姜黄在理血方剂中的配伍规律及系统药理机制分析

刘志强，杨尚玉，王博龙

1鹤壁职业技术学院 鹤壁市天然药物研究与开发重点实验室，鹤壁 458030；2宜春学院化学与生物工程学院，宜春 336000

中药姜黄为姜科植物姜黄CurcumalongaL.的干燥根茎，其气香特异，味苦、辛，归脾、肝经，有破血行气，通经止痛之功效[1]。姜黄以中药配伍于方剂，始自《太平惠民和剂局方》的五痹汤，以其理血止痛等效用，治疗风寒湿邪、客留肌肤等证[2]。后代医家多以姜黄为理血药用治于内科痹痛、妇科、骨伤、杂症等领域。此外，姜黄在伊朗、印度、泰国等地也常做为民族药材或保健食品，用以治疗皮肤病、感染、精神疾病等[3]。鉴于姜黄能对多种疾病产生治疗作用，近年来，国内外不少学者为研究姜黄的分子药理机制做出了不懈努力。Eleonora等[4]综述了姜黄的现代药理机制，发现其具有改善代谢紊乱、改善慢性疾病、调节机能、抗氧化、保健等作用。Deguchi等[5]发现姜黄及其主要功效成分姜黄素安全性高，能介导多个靶点与多条通路发挥抗炎、抗肿瘤等作用。中国对姜黄的药理作用研究多集中在其抗肿瘤、抗炎、降血糖及对心血管系统的影响[6]。

尽管当前研究揭示了姜黄的许多药理机制，但多局限于对姜黄单一药材或其成分的研究，鲜有对其配伍规律、复方协同药理机制进行研究者。姜黄做为中医方剂组份治疗疾病，其功效作用必然受到配伍药物的相互影响。中医药理论认为“药有个性之长，方有合群之妙”，方剂组份君、臣、佐、使功能作用各不相同，《神农本草经》中有“相须、相使者良，相恶、相反者勿用”等论述[7]。因此，探索姜黄的药理作用不能仅局限于对其自身的研究，还应对其组方配伍进行整体分析。数据挖掘技术的进步为研究中医药配伍关联规律提供了新的方法，其中Apriori关联算法、广义规则归纳(generalized rule induction，GRI)算法为常用的简单关联规则算法，能有效地挖掘出方剂中关联度强的核心药对、药方，既简化了方剂成分数量，又不失中医配伍之妙，在中药配伍规律、核心组方的发现中应用最为广泛。例如，唐启盛[8]等利用广义规则归纳(GRI)关联规则算法进行数据分析，发现了治疗焦虑的传统中药核心配方，即柴胡-郁金、酸枣仁-生龙骨等。本研究基于数据库挖掘技术原理，利用GRI算法、Arrowsmith知识发现工具、生物信息学数据库等手段，研究中药姜黄在理血方剂中配伍规律及其药理机制，以期为开发新一代姜黄产品提供理论支持和技术线索。

1 材料与方法

1.1 数据来源与处理

本研究将《中医方剂大词典》[9]中所有方剂资料构建数据库。按照纳入标准，检索收集符合要求的姜黄方剂。(一)纳入标准：①方剂中含有姜黄，且符合理血方剂的概念。理血剂应符合《方剂学》(第九版)[10]标准且由两位副高职称以上中医师或中西医结合医师认定。②为体现姜黄在方剂中的规律性，应排除药味数>15的大方或姜黄在方中分量较轻的方剂。③排除外用的方剂。④同方异名者，以首现的古籍为准。(二)数据规范：按照2015年版《中华人民共和国药典》[11]对检索的方剂进行药物名称规范统一。如“玄胡索”、“元胡索”统一为“延胡索”，“芎”、“芎穷”统一为“川芎”等。

1.2 关联规律分析

采用GRI广义规则归纳算法进行关联规律的挖掘，以SPSS Clementine 12.0软件中的GRI建模模板进行计算。参数包括频次、支持度、置信度、提升。X中药支持度为含有X中药方剂数量与纳入方剂总数的比值；中药X→中药Y的置信度为含有中药X的方剂中包含中药Y的概率；中药X→中药Y的提升为“中药X→中药Y置信度”与“中药Y支持度”的比值。置信度反应药物组合同时出现的概率，置信度用于表示药物间联系的紧密性，提升度体现了中药X对中药Y在方剂中出现概率的提升能力，三者应综合考量以反应姜黄在理血剂中的用药规律。

1.3 核心配伍靶标的数据挖掘

利用Arrowsmith知识发现工具挖掘探索姜黄核心配伍的协同药理机制。在Arrowsmith检索界面输入A集合检索词为姜黄的拉丁名与中文拼音名(“Curcumalonga” or “Jianghuang”)，输入C集合检索词为姜黄核心配伍中其他药物名，例如，当归为(“Angelicasinensis”or“Danggui”)，川芎为(“Ligusticumchuanxiong” or “Chuanxiong”)等。然后使用Arrowsmith工具将A集合和C集合关联，设置检索语义为“Genes & Molecular Sequences,and Gene & Protein Names”得到A集合与C集合相关的集合B，从而发现姜黄与其配伍药物的共同相关靶点、靶蛋白，以此为两者协同药理机制的基础靶标。

1.4 药理机制预测

利用STRING蛋白质相互作用数据库(https://string-db.org/)和KOBAS 3.0数据库(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/?t=1)，对数据挖掘得到的姜黄核心组方靶标进行药理分子机制分析。并利用Uniprot、Protein atlas和FunRich3.1.3数据库预测靶基因的组织分布、细胞分布。综合以上信息归纳姜黄核心组分的潜在药理机制。STRING数据库参数设置：物种为“Homo sapiens(智人)”，相互作用数据来源为文本挖掘(textmining)、实验(experiments)、数据库(databases)，阈值设为高“high confidence = 0.7”。KOBAS 3.0数据库设置：物种为“Homo sapiens(智人)”、通路为“KEGG Pathway、KEGG Disease”。

1.5 体外抗肿瘤机制的药理测定

2 结果

2.1 姜黄方剂的配伍关联规律

按照纳入标准，在《中医方剂大词典》数据库共挖掘到姜黄理血方剂47首，包含中药126味。两味药组合最常见配伍如表1所示，“姜黄-当归”频次29、“姜黄-川芎”频次15、“姜黄-赤芍”频次14，为排名前三的组合。根据关联规则GRI算法，姜黄配伍3味药关联规律如表2、图1所示，其中“姜黄、川芎→当归”(置信度93.33%、支持度31.91%、提升1.51)组合的关联性最强。表示“姜黄、川芎”配伍频率为31.91%，“姜黄、川芎”出现时，当归有93.33%概率同时出现，比当归单独出现的概率61.70%(见表1)提升了1.51。说明“姜黄-当归-川芎”组方频次最高，川芎还能提升“姜黄-当归”的出现频率，该组方很可能是姜黄理血方剂的核心配伍。“姜黄、赤芍→当归”和“姜黄、蒲黄→赤芍”组合的频次、关联性位居第二、第三，也是姜黄理血方剂的较好配伍形式。

表1 姜黄配伍2味药组合频次表

续表1(Cotinued Tab.2)

表2 姜黄配伍3味药关联规律

2.2 “姜黄-当归-川芎”配伍的靶蛋白预测

通过GRI关联算法分析，发现“姜黄-当归-川芎”是姜黄理血方剂的核心配伍。下一步运用Arrowsmith工具将姜黄(“Curcumalonga” or “Jianghuang”)文献集合与当归(“Angelicasinensis”or“Danggui”)文献集合关联，发现“姜黄-当归”靶点条目227个，关联分数0.95以上条目33个。姜黄(“Curcumalonga” or “Jianghuang”)文献集合与川芎(“Ligusticumchuanxiong”or“Chuanxiong” )文献集合关联，发现“姜黄-当归”靶点条目175个，关联分数0.95以上条目22个。如图2、表3所示，“姜黄-当归-川芎”关联分数大于0.95共同靶点13个。13个靶点涉及相关家族基因27个。

图1 散点图Fig.1 Scatter diagram

图2 靶点数量韦恩图 (score ≥ 0.95)Fig.2 Venn diagram of number of targets (score ≥ 0.95)

2.3 靶点的PPI网络与组织分布

如图3所示，将13个潜在靶点(27个基因)进行PPI(Protein-protein interaction network)网络分析，构建了27个基因、88条相互作用的PPI网络。利用Cytoscape软件cytoHubba插件预测网络Hub基因，发现网络节点的平均度值为6.52，平均最短距离为51.03×10-2，平均介数4.09×10-2，其中AKT1、PIK3CA、RELA、NFKB1、MAPK14、VEGFA的三个网络参数超过了平均值，是PPI网络的枢纽节点，可能是“姜黄-当归-川芎”靶点网络的Hub基因。

表3 “姜黄-当归-川芎”的共同靶点(关联分数大于0.95)

利用Uniprot、Protein atlas和FunRich3.1.3数据库分析靶基因的细胞分布、组织分布情况，结果如图4、表4所示，靶基因在组织的分布大多表达于单核/巨噬细胞、NK细胞、B细胞、血小板等免疫细胞，而在其他器官的表达并不均匀。在细胞分布则有质膜、细胞质、细胞核、外泌等各种形式。

2.5 KEGG通路分析

利用KOBAS 3.0数据库，将“姜黄-当归-川芎”的13个潜在靶点(27个基因)进行KEGG通路富集，其中P-value<0.01的前四十条通路结果如图5所示：8条通路与癌症相关；12条通路与感染和炎症相关；8条通路为信号转导通路；5条通路与神经内分泌相关；5条通路参与了一般生物过程；还有2条通路与其他疾病相关。

图3 PPI网络Fig.3 PPI network

表4 PPI网络的节点参数

综上，四十条通路可简要归纳为图6～8所示，推测“姜黄-当归-川芎”可能具有通过调控PI3K/Akt、MAPK、Toll-like receptor、T cell receptor、EGFR、VEGFR、Apoptosis、HIF-1等信号通路，发挥增强免疫力、抗炎、改善微循环、保护脑神经以及抗肿瘤、抗肿瘤血管生成等潜在药理作用。

2.6 组方A549细胞的抑制率

利用5 g姜黄，5 g川芎和5 g当归制成粉末，将300 mL水煎至150 mL，过滤除去残留物，然后加入300mL水中，最后浓缩至150 mL(相当于中药100 mg/mL)。我们使用MTT测定法定量了A549细胞的抑制率和增殖。对数生长期的A549细胞分为六组(每组3孔)。第1组至第5组中分别添加100、50、25、12.5、6.25 mg/mL的草药提取物100 μL，对照组则添加100 μL DMSO。在二氧化碳培养箱中孵育24、48、72 h后，我们通过每孔添加20 μL MTT(5 mg/L)除去。温育4 h后，用DMSO终止反应。最后，通过酶标仪在570 nm下测量每孔的吸光度。抑制率=(1-OD实验/ OD对照)×100%。结果显示在表5和图9中。“姜黄-川芎-当归”配方可以剂量和时间依赖性抑制肿瘤细胞的增殖。

图4 组织分布Fig.4 Tissue organ location

图5 通路富集Fig.5 Pathway enrichment

图6 调控血管生成Fig.6 Regulating angiogenesis

图7 调节免疫反应Fig.7 Regulate immune response

图8 抗肿瘤Fig.8 Antitumor

表5 不同浓度组方对A549细胞的抑制率

图9 不同浓度组方对A549细胞抑制率的影响Fig.9 Effect of formula with different concentrations on the inhibition ratio of A549 cells

2.7 靶蛋白p-EGFR、p-PI3K、p-Akt、VEGF和HIF-1α体外测定的体外表达

通过Human Protein Atlas数据库进行的生物信息学免疫组织化学分析表明，在正常肺组织中PI3K、EGFR未表达，AKT低表达，但在肺癌组织样品中PI3K、EGFR、AKT明显表达(见图10)。基于Western blotting检测了p-EGFR、p-PI3K和p-Akt在A549肺癌细胞的表达(见图11)。将人类A549细胞分为四组(每组3孔)：对照，小剂量(6.25 mg/mL)、中等剂量(12.5 mg/mL)、高剂量(25 mg/mL)。证明“姜黄-川芎-当归”配方可以明显抑制培养基中p-EGFR、p-PI3K和p-Akt的表达。孵育24 h后，我们通过Elisa分析检测了VEGF、HIF-1α的表达。“姜黄-川芎-当归”配方可显着抑制各剂量组的VEGF、HIF-1α的表达(见表6)。

3 讨论

理血剂是一类具有调畅血行、散除瘀血、凉血止痛等效果的中医方剂，现代医学常用以治疗外伤肿痛、妇科炎症、心脑血管疾病、肿瘤癌症等。本研究发现的姜黄核心配伍“姜黄-当归-川芎”中川芎属于活血化瘀药，而当归属于活血补血药。姜黄与川芎、当归配伍具有较好的中医配伍理论依据。川芎为血中气药，兼有行气止痛之效，气行则血畅，故能增强姜黄、当归活血化瘀之力[12]。当归为补血圣药，能祛瘀生新，与姜黄、川芎配伍祛邪扶正、攻补兼施[13]。古代经典名方“四物汤”便有当归配伍川芎的用法。Li等[14]研究发现当归与川芎配伍后治疗血瘀大鼠比单独当归、单独川芎疗效更佳。Deng等[15]总结通过数据挖掘古今名方，发现姜黄具有治疗脑病的作用，并且最善与活血化瘀药当归、川芎等配伍，于本研究数据挖掘结论基本一致。综上，说明当归、川芎与姜黄具有协同增效的配伍依据，但后续仍需进一步实验分析姜黄与当归、川芎增效机制。

本研究首先通过Arrowsmith知识发现工具，发现了“姜黄-当归-川芎”能联合作用于AKT、TLR4、caspase-3、PI3K、mTOR、p38 MAPK、VEGF、iNOS、Nrf2、BDNF、NF-κB、Bcl-2、Bax等13个靶点，涉及相关基因27个。PPI与通路富集显示“姜黄-当归-川芎”能通过AKT1、PIK3CA、RELA、NFKB1、MAPK14、VEGFA等Hub基因，参与调控PI3K/Akt、MAPK、Toll-like receptor、T cell receptor、EGFR、VEGF、Apoptosis、HIF-1等信号通路，预测其可能具有增强免疫力、抗炎、改善微循环、保护脑神经以及抗肿瘤、抗肿瘤血管生成等潜在药理作用。

图10 PI3K、Akt、EGFR在肺癌组织中过表达Fig.10 PI3K, Akt, EGFR is overexpressed in lung cancer tissues

表6 组方对A549细胞VEGF和HIF-1α表达的影响

Liu等[16]发现姜黄能抑制AKT/mTOR途径而导致卵巢癌细胞SK-OV-3细胞凋亡。Ashrafizadeh等[17]发现姜黄通过靶向Nrf2信号通路具有多种作用，包括抗氧化剂，抗菌，抗肿瘤和抗炎作用。此外，有研究表明川芎和当归也可以发挥抗肿瘤作用，Shen等[18]使用RT-qPCR和Western blotting分析表明，川芎能显着降低Akt的表达和活性，增加caspase-3的活性，并且还显示出对多种类型的癌症具有抗肿瘤作用。当归可以通过抑制mTOR蛋白诱导胃癌细胞死亡，并可以显着延长癌症患者的生存率[19]。当归还影响多种凋亡因子Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-2和caspase-3的表达并促进人乳腺癌细胞的凋亡，因此已被证明是一种有前途的乳腺癌治疗剂[20]。另外，“姜黄-当归-川芎”配方可能具有抗肿瘤血管生成作用。有ELISA分析表明，姜黄能抑制肿瘤细胞中VEGF的分泌，进一步抑制了肿瘤血管生成[21]。Chen等[22]发现当归可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路并下调HIF-1α和VEGF的表达来预防癌细胞的增殖和血管生成。这些研究表明“姜黄-当归-川芎”配方可发挥抗肿瘤作用。我们的结果与上述研究基本一致。

此外，本研究推测“姜黄-当归-川芎”配方还可以显示抗炎，保护脑神经的作用以及改善微循环的作用。Zhu等[23]使用免疫组织化学，酶联免疫吸附测定和蛋白质印迹，证明姜黄能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减轻实验性颅脑损伤的急性炎症损伤。有研究表明当归可以上调TLR4蛋白的表达，具有抗炎和镇痛的药理作用[24]。川芎能通过抑制p38 MAPK和NF-κB信号通路，使炎症性细胞因子和粘附分子在血管内皮细胞上的表达降低。这些研究证实了“姜黄-当归-川芎”配方抗炎作用的假设。Wu等[25]发现姜黄可以通过上调caspase 3和Bcl-2的表达，下调Bax的表达并促进PI3K/AKT途径的活化而对缺血性脑损伤发挥有益作用。Hurley等[26]研究表明姜黄能导致海马BDNF剂量依赖性增加，具有保护脑神经作用。Cheng等[27]发现当归可通过下调caspase 3和上调p-p38 MAPK，缺氧诱导因子(HIF-1)，血管内皮生长因子-A(VEGF-A)来保护患者免受脑梗塞并改善神经系统损害。Chen等[28]发现当归四逆汤可以有效地通过PI3K/Akt/iNOS途径保护胰岛微血管的微血管内皮细胞。我们的结果与以上研究一致，证明了“姜黄-当归-川芎”配方保护脑神经和改善微循环的药理作用。

图11 通过Western blotting在A549细胞中p-EGFR、p-PI3K和p-Akt的表达Fig.11 The expression of p-EGFR, p-PI3K and p-Akt in A549 cells by Western blotting注：A：对照组：B：小剂量；C：中剂量；D：高剂量Note: A: Control; B:Small-dose; C: Medium-dose; D: High-dose

最后，本研究使用MTT、Elisa和Western blotting实验，发现“姜黄-当归-川芎”配方可以抑制人肺癌A549细胞增殖并下调A549细胞中p-EGFR、p-PI3K、p-Akt、VEGF和HIF-1α的表达。这些实验表明“姜黄-当归-川芎”配方在体外确实具有抗癌和抗肿瘤血管生成作用，证明数据挖掘信息可靠有效、可以预测中药的某些药理机制。本研究结果为中医药的发展和药理作用机理研究提供了方法参考。