白及非多糖组分止血活性成分研究

赵菲菲，李 靖，徐国波,，王永林，席晓岚，廖尚高,*

1贵州医科大学药学院，贵阳 550004；2贵阳市第一人民医院药剂科，贵阳 550001；3贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵阳 550004

白及为兰科植物白及(Bletillastriata(Thunb.) Reichb.F.)的干燥块茎，又名甘根、白根、地螺丝等，是《中国药典》收载的常用中药之一，具有收敛止血、清热利湿、消肿生肌之功效，临床上主要用于咯血、吐血、外伤出血等治疗[1,2]。化学研究表明白及药材中除含有大量多糖类物质外，还含有较多的非多糖类物质，如芪类、联苄类、菲类、联菲类等近五十种化学成分[3-8]。近年来，我国科研人员对白及药材的药理研究主要集中在白及的多糖部分，但随着白及药材中化学成分研究的不断深入，白及非多糖部分也成为药理活性研究热点。本课题组在前期研究中已证实BS-80EE[9-12]具有良好的止血药效，它可显著缩短肝素化的小鼠出血时间和凝血时间(CT)；可刺激大鼠血小板的活化，使血小板聚集作用增强；可作用于凝血纤溶系统，加速血液的凝固，抑制纤维蛋白降解，同时使血液黏度增加，血流速度变慢而发挥止血作用。但BS-80EE发挥止血的药效物质基础尚不明确，因此本研究采用超高压液相色谱-电喷雾-四级杆-飞行时间串联质谱(UHPLC-ESI-Q-TOF MS)对BS-80EE中的化学成分进行分析，明确其主要化学成分，并采用ADP、THR诱导的血小板聚集实验和小鼠CT实验对已确认的化学成分进行止血活性评价，以期初步阐明BS-80EE发挥止血的活性物质。

1 材料与试剂

1.1 动物

SPF级KM小鼠(雌雄各半)，体质量20～22 g；SPF级SD大鼠(雌雄各半)，体质量200～240 g；均由贵州医科大学实验动物饲养中心提供，许可证号：SCXK(黔)2012～0001。实验动物在室温22～24 ℃，相对湿度为60%条件下自由摄食饮水，实验前适应性饲养7天。

1.2 药品与试剂

白及非多糖组分(BS-80EE)(实验室自制[9])；硫酸鱼精蛋白注射液(批号09150303，北京悦康凯悦制药有限公司)；酚磺乙胺注射液(批号20160715，国药集团容生制药有限公司)；水合氯醛(批号20151220，国药集团化学试剂有限公司)；ADP(批号91M7002V，Sigma公司)；凝血酶(THR，批号20160921，北京索莱宝科技有限公司)；甲醇(色谱纯，德国Merck 公司)；乙腈(色谱纯，德国Merck 公司)；甲酸(美国TEDIA有限公司，色谱纯)；纯净水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)；对照品4-hydroxymethylphenylβ-D-glucoside、α-isobutylmalic acid、blestroside、dactylorhin A、gymnosides I、militarine、4,7-dihydroxy-2-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene、gymnosides V、gymnosides Ⅸ、4,7-dihydroxy-p-hydroxybenzyl-2-methoxy-9,10-dihydrophena nthrene armatuside以及1-p-hydroxybenzyl -4-methoxyphenanthrene-2,7-diol均为实验室自制(纯度≥95%)。

1.3 仪器

LGPABEER型血小板聚集凝血因子分析仪(北京世帝科学仪器公司)；ESI-Q-TOF MS(布鲁克道尔顿电喷雾-四极杆-飞行时间质谱仪，包括Metabolite ToolsTM、MDF技术等)；Agilent Technologies 1290 Infinity液相色谱系统(配有1290 Infinity二元泵，高性能自动进样器，二级管阵列检测器，柱温箱)；Multifuge X3R高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；METTLER AE240十万分之一电子天平(梅特勒-脱利多仪器上海有限公司)。

1.4 供试品配制

1.4.1 标准品

分别称取上述12种对照品适量，加入甲醇至1 mL超声溶解，10 000 rpm离心10 min，取上清液于进样瓶中备用，即得混合标准溶液。

1.4.2 BS-80EE溶液

称取2 mg的BS-80EE，用甲醇2 mL超声溶解，10 000 rpm离心10 min，取上清液于进样瓶中备用。

1.4.3 硫酸鱼精蛋白注射液

取适量硫酸鱼精蛋白注射剂，用生理盐水稀释，配成0.16 mg/mL浓度，临用前配制。

1.4.4 肝素钠注射液

取适量肝素钠注射剂，用生理盐水稀释，配成16 U/mL活性浓度，现用现配。

1.4.5 酚磺乙胺注射液

取适量酚磺乙胺注射剂，用生理盐水稀释，配成5 mg/L活性浓度，现用现配。

1.4.6 白及各单体化合物

分别称取白及各单体化合物100 mg或80 mg溶于20 mL生理盐水中，超声溶解，配制成5 mg/mL或40 mg/mL浓度，备用。

2 实验方法

2.1 BS-80EE化学成分分析

2.1.1 色谱条件

色谱柱 Waters BEH C18(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)柱，柱温：45 ℃，流动相：0.1% 甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，洗脱梯度见表1，进样体积2 μL。

2.1.2 质谱条件

电喷雾电离源(ESI)，扫描方式为正、负离子扫描(ESI+、ESI-，m/z50～1 500)；毛细管电压(正离子模式4 kV，负离子模式3.5 kV)，锥孔电压：80 V，离子源温度：110 ℃，雾化气(N2)压力：1.3 bar，流速：6.0 L/min，温度:200 ℃，脱溶剂气温度：300 ℃，气体体积流量：50 L/h，脱溶剂气体积流量：550 L/h，准确质量测定采用甲酸钠校正标准液，校正模式选用：Enhanced Quadratic。数据用HystarPP软件(BrukerDaltoniks)进行分析。

表1 洗脱梯度表

2.2 ADP、THR诱导的大鼠血小板聚集率的测定

取SD大鼠数只，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，使用3.8%枸橼酸钠抗凝真空采血管大鼠腹主动脉釆集血样。将血样800 rpm离心10 min，分离上层血浆即得富血小板血浆(PRP)，余下血液部分3 000 rpm离心10 min，分离上层血浆即得贫血小板血浆(PPP)，用PPP调PRP中血小板的计数为(2～3)×1011/L。用PPP调零后，取PRP 290 μL与各单体化合物(5 mg/mL)10 μL于37 ℃共同孵育60 s，加入终浓度为5 μmol/L ADP或10 U/L THR 10 μL，记录5 min内血小板的最大聚集率。

2.3 肝素化小鼠凝血时间(CT)的测定

取KM小鼠120只(雌雄各半)，随机分为12组，每组10只，分为空白对照组(control，Con)、模型组(model，Mod)、鱼精蛋白组(protamine sulfate，PS)(1.6 mg/kg)、白及各单体(40 mg/kg)。各组小鼠每天尾静脉给药1次，空白组、模型组、鱼精蛋白组给予生理盐水20 mL/kg，其余各组给予相应剂量的药物，连续5天。第5天，给药60 min后除空白组外均尾静脉注射肝素钠，3.2 U/只(鱼精蛋白组15 min后尾静脉注射鱼精蛋白)，60 min后用内径1 mm，长10 cm的毛细玻璃管从小鼠内眼球后静脉丛取血，待血液充满玻璃管时开始计时，接着每隔30 s折断两端毛细玻璃管(约0.5 cm)，并缓慢向左右拉开，观察折断处有无血凝丝出现，从血液充满玻璃管开始至出现血凝丝所经历的时间作为小鼠凝血时间(CT),记录实验结果。

2.4 统计学方法

3 实验结果

3.1 BS-80EE中化学成分分析

利用UHPLC-ESI-Q-TOF MS对BS-80EE化学成分进行检测分析，共表征了18个化学成分(见图1)。在正离子模式下，通过比较BS-80EE样品和对照品的保留时间(tR)及质谱数据(见表2)，确定了BS-80EE中的11个化合物(1、5、6、7、8、10、11、14、16、17和18，结构见图2)；在负离子模式下与对照品的保留时间(tR)及质谱数据对比，确定了6个化合物(1、3、7、8、10和18)。由图1中的A、C色谱图可知，BS-80EE中含量较大的化合物有2、3、5、7、8、10、17、18，为BS-80EE的主要成分。

3.2 BS-80EE中单体成分对ADP、THR诱导的大鼠血小板聚集的影响

对BS-80EE中12个化合物进行止血活性评价，由实验结果可知，与空白组相比，阳性药酚磺乙胺(etamsylate，Etam))可显著增加ADP诱导的大鼠血小板聚集率(P<0.01)，对THR诱导的血小板聚集无显著影响(P>0.05)。

对ADP诱导的大鼠血小板聚集反应，与空白组相比，化合物1、5、7、14和17均可显著增加血小板聚集率(P<0.05或0.01)，化合物3、10、11、18显著抑制血小板聚集率(P<0.01)，化合物6、8、16则对血小板聚集反应无显著影响(P>0.05)(见图3)。

对THR诱导的大鼠血小板聚集反应，与空白组相比，化合物1、5、6、7、8、11、14和17均可显著增加血小板聚集率(P<0.05或0.01)，化合物3、18显著抑制血小板聚集率(P<0.01)，化合物10、16则对血小板聚集反应无显著影响(P>0.05)(见图4)。

3.3 BS-80EE中单体成分对肝素化小鼠CT的影响

结合上述BS-80EE化学成分分析结果，我们对能够获得单体的化合物进行了肝素化小鼠体内毛细管凝血时间实验。结果显示，与空白对照组相比，阳性药鱼精蛋白可显著缩短肝素化小鼠CT值(P<0.01)，化合物1、3、5、7、8、14和18也可不同程度的显著缩短肝素化小鼠CT值(P<0.05或0.01)，化合物10、17对肝素化小鼠CT值无显著影响(P>0.05)(见图5)。

图1 BS-80EE(A)和混合标准品(B)在ESI+模式下的TIC色谱图；BS-80EE(C)和混合标准品(D)在ESI-模式下的TIC色谱图Fig.1 Total ion current (TIC) chromatograms of BS-80EE (A) and mixed samples (B) in the positive ion mode;TIC chromatograms of BS-80EE (C) and mixed samples (D) in the negative ion mode

表2 BS-80EE中化合物的色谱和质谱数据

续表2(Continued Tab.2)

图2 BS-80EE中鉴定出的化合物Fig.2 Compounds identified from BS80EE

图3 BS-80EE中单体成分对ADP诱导的血小板聚集的影响Fig.3 Effects of different compounds from BS-80EE on platelet aggregation induced by ADP in rats s,n =4)注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。Note:*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

图4 BS-80EE中单体成分对THR诱导的血小板聚集的影响Fig.1 Effects of different compounds from BS-80EE on platelet aggregation induced by THR in rats s,n=4)注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。Note:*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

图5 BS-80EE中单体成分对肝素化小鼠CT的影响((x ± s,n =10) Fig.5 Effects of different compounds from BS-80EE on CT of heparinized mice s,n =10)注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。Note:##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group.

4 讨论

超高压液相色谱-电喷雾-四级杆-飞行时间串联质谱(UHPLC-ESI-Q-TOF MS)联用技术是一种同时具备高通量分析检测及数据快速获取、处理的新型联用技术，具有高效、高灵敏度、专属性强、检测模式多样、分析速度快，并提供丰富的数据信息及数据处理的特点，该技术被广泛用于环境科学、蛋白质组学、中药化学成分鉴定等研究之中[13-15]。本实验采用UHPLC-ESI-Q-TOF MS对BS-80EE中化学成分进行分析，与对照品的保留时间，离子碎片信息进行比对，确认了BS-80EE中12个化学成分。

血小板在生理性止血过程中发挥着重要作用，而血小板活化、聚集是其发挥止血作用的前提。血小板的活化与激动剂密切相关，不同的激动剂激活不同的信号传导通路，进而引起血小板的聚集程度也有所差异。THR是一种强诱导剂，它可引起不依赖于颗粒内容物的聚集反应；弱诱导剂 ADP若要引起不可逆的聚集反应需要颗粒内容物分泌后的协助作用[16]，两者均常用于止血、促凝血药物的体外活性评价模型[16,17]。BS-80EE可显著增加血小板的聚集作用，故利用ADP、THR诱导的体外血小板聚集实验对BS-80EE中的主要化合物进行初步止血活性评价，结果显示化合物1、5、7、8、10、14、17可显著增加ADP或THR诱导的血小板聚集作用，化合物3、18可显著抑制ADP及THR诱导的血小板聚集作用，且由图1A、C可知，化合物5、7、8、17在BS-80EE中的峰面积明显大于化合物3、18，推测BS-80EE中各化合物对血小板聚集的促进作用之和明显大于抑制作用，进而使得BS-80EE对血小板聚集表现出促进作用。BS-80EE可显著缩短肝素化小鼠的CT值，故利用较为经典、常用的止血药效筛选指标小鼠CT实验[18]对BS-80EE中主要的且能够获得的9个化合物进行体内药效验证。结果显示化合物1、3、5、7、8、14、18均可显著缩短肝素化小鼠的CT值，化合物10和17对肝素化小鼠的CT值无明显影响，各化学成分的共同作用使BS-80EE表现出明显的促凝作用。值得注意的是在体外血小板诱导试验中，化合物3、18显著抑制血小板聚集，化合物10、17显著增加血小板聚集作用，而在体内肝素化小鼠CT实验时，化合物3、18表现出显著的促凝作用，10、17则无显著作用，提示化合物10和17可能只在体外发挥促凝作用或其在体内的促凝作用明显弱于肝素抗凝作用，而化合物3、18可能抑制血小板系统，但其在体内发挥的共同效应表现出促凝作用，故各个单体化合物的止血作用及机制有待进一步研究。

本研究采用UHPLC-ESI-Q-TOF MS分析确认了BS-80EE中12个化学成分，进一步利用ADP、THR诱导的血小板聚集实验和小鼠CT实验对其主要成分进行初步止血活性评价，发现化合物1、3、5、7、8、10、14、17、18可显著增加血小板聚集作用或缩短肝素化小鼠凝血时间，初步阐明了BS-80EE的止血活性物质，为白及非多糖组分的深度开发提供了实验基础。