艾纳香油中抗炎成分的筛选及其对炎性因子的影响

蔡亚玲，廖加美，彭俊超，高 月，王万林，易 琼，王 鲁*

1贵州大学药学院；2西南特色药用生物资源开发利用教育部工程研究中心，贵阳 550025

艾纳香Blumeabalsamifera(L.)DC为菊科艾纳香属草本植物，有着温中活血、祛风除湿、缓解伤寒感冒、杀菌止痒、预防关节发炎等功效[1-3]。艾纳香油作为艾纳香提取艾片的附属产品，文献报道艾纳香中有143个化合物[4]，实验室前期通过GC-MS检测鉴定出有39个挥发性的化合物，也报道艾纳香油在抗炎方面有着很好的药理活性[5]，但其抗炎药效的物质基础尚未阐明。本实验旨在对艾纳香油GC-MS检测出的含量较高挥发性的化合物抗炎药理学活性进行筛选，并研究其对巨噬细胞炎性因子的影响，评价其抗炎效果，为艾纳香油的深度开发提供理论依据，同时为中药抗炎作用的研究提供参考依据。

1 材料

1.1 药物及主要试剂

(-)-龙脑、樟脑、(-)-芳樟醇、反式-石竹烯、黄木素(Absin)；α-蒎烯、(+)-α-蒎烯、(-)-α-蒎烯、β-蒎烯、氧化石竹烯、α-胡萝卜烯(上海同田生物技术股份有限公司)；愈创木酚、β-丁香酚、1-辛烯-3-醇(Sigma)；槲皮素由贵州省生化工程中心分离鉴定，所有化合物纯度≥98%。硫酸特布他林片(terbutaline)(阿斯利康制药有限公司，批号：H32022694)；醋酸地塞米松(DEX)(遂成药业股份有限公司，批号：H41021038)；硫酸阿托品(湖北兴华制药有限公司，批号：20170602)；马来酸氯苯那敏、组胺(阿拉丁试剂公司)；弗氏完全佐剂(FCA)(Sigma)；DMEM高糖培养基、FBS(Gibco)；LPS(Sigma，血清型O11:B4)；PGE2、TNF-α、IL-1β和LTB4 Elisa试剂盒(武汉基因美生物公司)；NO、iNOS Elisa试剂盒(南京建成生物工程研究所)；卵清蛋白(OVA)、MTT(Solarbio)；BCA蛋白定量试剂盒(康为世纪生物技术公司)；RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit、FastKing RT Kit(With gDNase)(天根生物技术公司)；PowerUp SYBR Green Master mix(Thermo Scientific)；10×RIPA buffer和蛋白磷酸化一抗NF-κB-p65(Cell Signaling Technology)；NF-κB-p65、β-actin、山羊抗兔抗体和山羊抗鼠抗体(ImmunoWay Biotechnology Company)；Tyrode 台氏液所需药品试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

PHJ-1多功能恒温离体肠管及平滑肌实验槽(成都仪器厂)；MADLAB-4C/501H型生物信号采集处理系统(北京众实迪创科技发展有限责任公司)；MultiskanGo型全波段酶标仪(美国Thermo Fisher scientific公司)；qTOWER实时荧光定量PCR仪、多功能凝胶成像系统(德国Jena公司)；小型垂直电泳系统、T100TMThermal Cycler温度梯度PCR仪(美国BIO-RAD公司)；UV757CRT紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)。

1.3 动物和细胞

SPF标准SD大鼠(250±20 g)及昆明小鼠(体重18±2 g)、健康清洁级成年豚鼠(体重180±10 g)(动物许可证号：SYXK(渝)2018-0001)来源重庆腾鑫实验动物中心。SPF级动物饲养于SPF级动物实验室，清洁级饲养于普通实验室，试验过程中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见(2006)》规定。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞株，购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。

2 方法

2.1 艾纳香油中对慢反应物质(SRS-A)生成抑制和受体阻断的化合物筛选

实验前将吐温-80与化合物1∶1混匀、加入三蒸水形成乳化液，参考文献[6]，OVA致敏豚鼠，制备SRS-A，肠管离体固定，组胺定标，待肠管收缩稳定后加入SRS-A及受试药液，只加SRS-A为模型组，特步他林为阳性对照组，槲皮素为天然药物阳性对照组[7]，加50%吐温-80为溶剂组，记录豚鼠回肠活动曲线，每组重复3次，计算其平均收缩幅度。受试药物的药效用回肠收缩幅度抑制率表示，SRS-A生成抑制率=(空白组-药物组)/空白组×100%。

肠管处理同上，组胺定标后，各组分别加入Tyrode液(空白组)、50%吐温-80(溶剂组)、各药物(药物组)、特布他林液(阳性组)300 μL，记录各组药物作用后的肠管因空白组SRS-A引起的回肠收缩高度，与组胺引起回肠收缩的高度进行计量换算，计算出SRS-A的生成抑制率。每组重复3次，用热Tyrode液洗脱3次后再进行其他组测试。SRS-A受体拮抗率=(空白组-药物组)/空白组×100%。

2.2 目标化合物小鼠急性毒性试验及对小鼠耳廓肿胀的影响

根据“2.1”筛选结果，筛定5个化合物，经预实验确定100%致死量和0%致死量后，设剂量间距为0.75，按急性毒性试验要求进行，灌胃给药1次，剂量为0.2 mL/20 g体重，14天内观察记录小鼠死亡数量及毒性反应。参考文献[5]将96只昆明小鼠随机分成8组(详见表3)进行小鼠耳廓肿胀试验。化合物用量选用急性毒性实验的LD50值的1/20[8]，地塞米松[9](0.02 g/kg)为阳性对照组。耳廓肿胀抑制率=(溶剂组平均肿胀度-试验组平均肿胀度)/溶剂组平均肿胀度×100%。

2.3 目标化合物对大鼠佐剂关节炎的影响

将60只SD大鼠随机分为6组(详见图1)。参考文献[10]并进行调整，用0.1 mL FCA注入左脚掌皮层下致炎，空白组注入0.1 mL 0.9%氯化钠，造模前记录原始足厚度，造模第4天开始测量足肿胀，同时开始灌胃给药1 mL/只，药物按“2.1”方法配制，用量0.18 g/kg，连续灌胃10天，每3天测量一次足肿胀厚度，记录大鼠足掌肿胀程度。

2.4 目标化合物对RAW264.7细胞分泌炎症介质NO、iNOS、LTB4和PGE2的影响

先将RAW264.7细胞100 μL接种于96孔板中

表1 qPCR 引物序列及退火温度

(6×105个/mL)，采用MTT法检测不同浓度化合物对细胞的毒性，确定用药浓度。又将RAW264.7细胞500 μL接种于24孔板中(6×105个/mL)，在37 ℃，5%CO2培养箱中培养6 h后，设立空白组、模型组(500 ng/mL LPS)、给药组(500 ng/mL LPS+40、80、120 μg/mL各化合物)，每组3个复孔。继续培养12 h后，收集各孔细胞上清液，根据各ELISA试剂盒操作说明书，进行操作，检测细胞分泌NO、iNOS、LTB4和PGE2的含量。

2.5 目标化合物对RAW264.7细胞炎症相关蛋白的TNF-α、IL-1β、COX-2、5-LOX、FLAP、p65 mRNA表达的影响

RAW264.7细胞2 mL接种于6孔板中(6×105个/mL)，在37 ℃，5%CO2培养箱中培养6 h后，组别设置同“2.4”，继续培养12 h后，按文献[5]进行RT-qPCR方法进行，引物均由Invitrogen公司合成，引物序列及退火温度详见表1。以GAPDH为内参基因，结果用Ct值表示，采用2-△△Ct法进行相对定量分析。

2.6 目标化合物对RAW264.7细胞核转录因子p65蛋白表达水平的影响

细胞处理及组别设置同“2.4”方法，继续培养12 h后，参考文献[11]的方法进行Western blot检测p65蛋白表达，以β-actin作为内参，ImageJ软件分析条带灰度值计算蛋白表达量。

2.7 数据统计

3 结果

3.1 艾纳香油中部分化合物对SRS-A生成抑制和受体阻断的筛选结果

水浴槽体系中离体豚鼠肠管在0.1%的药物浓度下，与空白组相比，特布他林、槲皮素、(-)-龙脑、(-)-芳樟醇显著抑制SRS-A的生成(P<0.01)。特布他林、槲皮素、(-)-龙脑、(-)-α-蒎烯、(-)-芳樟醇对SRS-A的受体有显著拮抗抑制作用(P<0.01)。樟脑，反式-石竹烯，1-辛烯-3-醇对SRS-A的生成有抑制作用，但无显著差异(P>0.05)，而有文献报道[12,13]樟脑，反式-石竹烯具有抗炎作用，因此需做进一步验证。综合以上结果，对(-)-龙脑、(-)-α-蒎烯、(-)-芳樟醇、反式-石竹烯、樟脑做进一步筛选，结果详见表2。

3.2 目标化合物的小鼠急性毒性及对小鼠耳廓肿胀的影响结果

根据“3.1”筛选出的结果，进行化合物小鼠急性毒性实验，各化合物半数致死量(LD50)详见表3，毒性大小依次是：(-)-α-蒎烯>(-)-龙脑>樟脑>(-)-芳樟醇>反式-石竹烯。按LD50值的1/20用药，从表3中可看出，与空白组相比，阳性药物DEX以及反式-石竹烯、(-)-芳樟醇组均能显著或极显著抑制因二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀(P<0.05，P<0.01)；(-)-龙脑的抑制率达到9.02%，与空白组相比虽无显著差异(P>0.05)，但相较于樟脑和(-)-α-蒎烯也表现出更好的抑制作用，且在SAS-R生成抑制和受体拮抗试验中抑制率分别达到32.64%，47.3%，表现出很好的抗炎作用。综合以上结果，对(-)-龙脑、(-)-芳樟醇、反式-石竹烯做进一步筛选。

表3 目标化合物的小鼠急性毒性及耳廓肿胀实验结果

3.3 目标化合物对大鼠佐剂关节炎的影响结果

根据“3.2”的结果，我们筛选取(-)-芳樟醇、(-)-龙脑、反式-石竹烯3个化合物进行研究。由图1所示，在相同用药量下，(-)-芳樟醇和反式-石竹烯组均能显著或极显著降低FCA诱发的大鼠足趾肿胀(P<0.05，P<0.01)，其中(-)-芳樟醇效果略好于阳性药物DEX组，(-)-龙脑在9～17天时显著降低大鼠足趾肿胀(P<0.05)，但是在21～29天时与模型组相比，差异不显著(P>0.05)。

图1 大鼠佐剂关节炎足趾肿胀情况Fig.1 Toe swelling in rats with adjuvant s,n=10)注：与空白组比较，#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001；与FCA组比较，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。Note:Compared with control,#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001;Compared with FCA,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.

图2 (-)-芳樟醇、反式-石竹烯、(-)-龙脑对RAW 264.7细胞产生LTB4、PGE2、iNOS、NO的影响Fig.2 Effects of (-)-linalool,trans-caryophyllene and (-)-borneol on the production of LTB4,PGE2,iNOS and NO in RAW 264.7 s,n=3)注：A：空白对照组；B：LPS组；C：化合物40 μg/mL组；D：化合物80 μg/mL组；E：化合物120 μg/mL组；与空白组比较，*P< 0.01，**P< 0.01，***P< 0.001；与LPS组比较，#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.01；下同。Note:A:Control;B:LPS group;C:Compound 40 μg/mL group;D:Compound 80 μ g/mL group;E:Compound 120 μ g/mL group;Compared with control,*P< 0.01,**P< 0.001,***P< 0.001;Compared with LPS group,#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.01;The same below.

图3 (-)-芳樟醇、反式-石竹烯、(-)-龙脑对RAW 264.7细胞TNF-α、IL-1β、COX-2、5-LOX、FLAP mRNA表达的影响Fig.3 Effects of (-)-linalool,trans-caryophyllene and (-)-borneol on the expression of TNF-α,IL-1β,COX-2,5-LOX and FLAP mRNA in RAW 264.7 s,n=3)

3.4 目标化合物对RAW264.7细胞分泌炎症介质NO、iNOS、LTB4和PGE2的影响结果

细胞毒性试验结果表明，在24 h内(-)-芳樟醇、(-)-龙脑、反式-石竹烯三个化合物在0～500 μg/mL浓度范围下对加与不加LPS(500 ng/mL)培养情况下都不影响RAW264.7细胞活力。与空白组相比，LPS能极显著引起RAW264.7细胞分泌炎症介质PGE2、LTB4、NO、iNOS(P<0.01)。在一定浓度作用下，(-)-芳樟醇、反式-石竹烯能剂量依赖性的抑制LPS诱导的PGE2、LTB4、iNOS的释放(P<0.05，P<0.01)；(-)-芳樟醇能剂量依赖性的抑制LPS诱导NO的分泌(P<0.05，P<0.01)，反式-石竹烯不能显著抑制NO的分泌(P>0.05)；(-)-龙脑能剂量依耐性抑制iNOS、NO的释放(P<0.05，P<0.01)，也能抑制PGE2、LTB4的释放(P<0.05，P<0.01)，但剂量依耐性不好，结果如图2所示。

3.5 目标化合物对LPS致RAW264.7细胞炎症相关因子TNF-α、IL-1β、COX-2、5-LOX、FLAP mRNA表达的影响结果

与空白组相比，LPS能显著增加RAW264.7细胞TNF-α、IL-1β、COX-2、5-LOX、FLAP等炎症相关因子的mRNA表达(P<0.01，P<0.001)；(-)-芳樟醇、反式-石竹烯能剂量依赖性的抑制LPS诱导的TNF-α、IL-1β、COX-2、5-LOX、FLAP mRNA表达(P<0.05，P<0.01)；(-)-龙脑也能抑制TNF-α、IL-1β、COX-2、5-LOX、FLAP mRNA表达(P<0.05，P<0.01)，但不呈现浓度依赖性抑制作用，结果如图3所示。

3.6 目标化合物对LPS致RAW264.7细胞核转录因子p65表达水平的影响结果

与空白组相比，LPS能极显著增加p65 mRNA和蛋白的表达以及p65磷酸化(P<0.01)；(-)-芳樟醇、反式-石竹烯均能剂量依赖性的抑制LPS诱导RAW264.7细胞的p65 mRNA和蛋白的表达以及p65磷酸化(P<0.05，P<0.01)；(-)-龙脑的低、中剂量能抑制LPS诱导RAW264.7细胞的p65 mRNA和蛋白的表达以及p65磷酸化，但不呈现浓度依赖性抑制作用，甚至高剂量能促进p65的表达，结果如图4所示。

图4 (-)-芳樟醇、反式-石竹烯、(-)-龙脑对RAW 264.7细胞p65 mRNA及蛋白表达的影响Fig.4 Effects of (-)-linalool,trans-caryophyllene and (-)-borneol on mRNA and protein expression of p65 in RAW 264.7 s,n=3)

4 讨论

文献及相关数据报道[4]艾纳香中有143个化合物，主要集中在挥发油和黄酮类成分上，有：L-龙脑、樟脑、α-蒎烯、β-石竹烯、石竹烯氧化物、芳樟醇等，实验室前期通过GC-MS检测鉴定出艾纳香油中有39个挥发性成分，为了探明这些成分是否具有抗炎活性，作者选取含量在1%以上的14个挥发性的化合物进行抗炎活性研究。SRS-A是含多种LTs的复合物，属于花生四烯烟酸(AA)代谢中的脂氧化酶次级产物，可导致支气管炎、肺气肿以及肺源性心脏病等呼吸系统疾病[14]，SRS-A生成抑制剂和受体阻断剂的研究已成为寻找新型抗炎免疫药的重要方向，因此作者通过离体致敏豚鼠回肠试验初步筛选到(-)-龙脑、(-)-α-蒎烯、(-)-芳樟醇、反式-石竹烯、樟脑等5个具有抗炎潜质的化合物。再采用动物急性和慢性炎症模型，进一步筛选到(-)-芳樟醇、反式-石竹烯(-)-龙脑3个艾纳香油的重要的抗炎活性成分。至于本研究未涉及，且文献未报道的艾纳香油中其他化合物中是否也具有抗炎活性，这有待进一步深入研究。

AA作为机体内常见脂肪酸的重要物质，其代谢途径主要以COX途径为主，其次是LOX途径，能促进PG和LTs的释放，其中12-LOX则能催化iNOS诱导NO生成[15]，FLAP是作为细胞膜的组合蛋白，介导着LOX的传递[16]，它们在炎症过程中都起着炎症介质作用，抑制上述产物可减少炎症发生。NF-κB作为炎症反应的关键信号传导因子，在炎症细胞因子介导的炎症反应中起中心作用，它可以诱导炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β等)的基因表达，使炎性反应级联放大[17]。NF-κB-p65是NF-κB信号通路中的核心蛋白，过度的炎症反应会导致NF-κB-p65的表达增加。本文结果表明，(-)-芳樟醇、反式-石竹烯对这些炎症介质及细胞因子有抑制作用，(-)-龙脑对它们也表现出抑制作用，但剂量依耐性不好。有相关文献报道了它们对COX-2、iNOS、NO、PGE2这些炎症介质的抑制作用[13,18,19]，而对5-LOX、FLAP、LTB4的研究则较少，因此本研究也对丰富它们的抗炎机制提供了数据。综上结果提示，(-)-芳樟醇、反式-石竹烯是艾纳香油中的重要抗炎物质。

致谢：感谢国家自然科学基金对本项目的支持，感谢贵州大学为我们提供科学实验平台以及良好的学习环境，感谢我的导师王鲁教授,易琼师姐、廖加美、彭俊超、高月、王万林(贵州大学，西南特色药用生物资源开发利用教育部工程研究中心)等同学对本研究的悉心指导和帮助。