基于网络药理学研究胆舒胶囊治疗慢性胆囊炎的机制

冯炜业 柯璐琳

慢性胆囊炎为相当常见的消化系统疾病，多由胆结石所致胆囊壁炎症，或胆汁瘀积、感染导致急性胆囊炎反复发作拖延不愈而致[1]。这几年，中医药在医治慢性胆囊炎上发挥了重要作用，在一定程度上补充了西药治疗疗效不佳的情况。

胆舒胶囊中主要活性成分为薄荷素油，其为新鲜的唇形科薄荷的茎和叶经一系列加工获得的挥发油。薄荷是传统的食药两用植物，具有抑菌、抗炎、止痛、抗癌、解痉等生物活性，临床上可将其为单方或复方治疗慢性胆囊炎，但在薄荷治疗慢性胆囊炎的分子机制上的研究报道甚少。本文基于网络药理学方法，筛选出胆舒胶囊中君药薄荷的主要有效活性成分和发挥作用的靶点，探究慢性胆囊炎的已知疾病靶点，分别绘制PPI及“薄荷-有效活性成分-交集治疗靶点-疾病”网络图，并进行分析；依托Bioconductor数据库，运用R语言软件及clusterProfiler等数据包对靶点基因本体(GO)的生物进程(BP)、分子功能(MF)、细胞成分(CC)3个水平及KEGG信号通路进行分析，为胆舒胶囊治疗慢性胆囊炎分子机制的进一步探索提供参考。

1 材料

TCMSP数据分析平台；Pubchem数据库；Swiss target predict数据库；GeneCards数据库；OMIM数据库；Uniprot数据库；String数据库； Venny 2.1.0软件； Cytoscape 3.7.2软件；Bioconductor数据库；R语言软件；clusterProfiler等数据包等。

2 方法

2.1 主要活性成分及作用靶点的筛选基于TCMSP平台，“薄荷”为关键词，选择口服生物利用度(OB)≥30%并且类药特性(DL)≥0.18作为筛选条件[2]，同时结合杨倩[3]的报道，获得相关的化合物成分。将筛选后的化学成分导入Pubchem服务器，得到化学成分2D结构的SDF文件。最后，运用Swiss target predict数据库，导入化学成分的SDF文件，选择物种为“智人”，选择Probability值>0的靶点，剔除未获得靶点的成分，剔除重复靶点，获取活性成分靶基因，并经过Uniprot蛋白数据库对靶基因进行注释。

2.2 疾病靶点的收集分别在GeneCards及OMIM数据库、以“chronic cholecystitis”为关键词，搜集与慢性胆囊炎发病的相关靶基因，合并2个数据库疾病靶点，剔除重复值，获得慢性胆囊炎疾病靶点。

2.3 PPI网络图的绘制与分析运用 Venny 2.1.0软件将薄荷活性成分靶点与慢性胆囊炎疾病靶点进行交集，得到胆舒胶囊医治慢性胆囊炎的治疗靶点。将获得的治疗靶点上传String在线数据库，得到蛋白互作网络，并对网络图中的核心基因进行分析。

2.4 “薄荷-有效活性成分-交集治疗靶点-疾病”网络图的构建将薄荷、有效活性成分、交集治疗靶点、疾病间相互关系导入 Cytoscape 3.7.2软件，构建“薄荷-有效活性成分-交集治疗靶点-疾病”网络图。

2.5 GO与KEGG富集分析依托Bioconductor数据库，R语言软件及clusterProfiler等数据包对胆舒胶囊治疗靶点的生物进程、分子功能、细胞成分3个水平进行GO富集分析；同样方法进行KEGG富集分析，R语言绘制KEGG信号通路富集分析高级气泡图，以揭示胆舒胶囊治疗慢性胆囊炎的分子机制。

3 结果

3.1 药物靶点及疾病靶点的确定TSMCP平台检索得到薄荷化学成分有164个，符合筛选条件的化学成分10个，分别为金柑苷、金合欢素、蒙花苷、豆甾醇、谷甾醇、柚皮素、芦荟大黄素、圣草酚、芫花素、木犀草素；结合文献报道薄荷挥发油含量高的4个活性成分，分别是L-薄荷酮、胡椒酮、L-薄荷醇、胡薄荷酮；在Swiss target predict数据库剔除未获得成分对应靶点的芦荟大黄素以及未与疾病靶点获得交集的胡薄荷酮，筛选出薄荷化学成分12个，薄荷作用靶点270个，见表1。经过GeneCards与OMIM数据库检索，整合获得慢性胆囊炎疾病靶点502个，运用Venny 2.1.0软件取薄荷与慢性胆囊炎疾病靶点交集，见图1。得到治疗靶点36个，见表2。

表1 薄荷关键化合物

图1 韦恩图

表2 薄荷治疗慢性胆囊炎的关键靶点

3.2 PPI网络将治疗靶点上传String数据库，物种设置为“智人”，选择medium confidence(0.400)，隐藏离散点，得到靶点相互作用网络图，见图2。其中节点代表治疗靶点，“边”代表治疗靶点之间的关联，其粗细用结合分数表示，“边”越粗结合分数值越大，代表其结合度越大。由R语言软件绘制出节点数排名前20的核心基因条形图，横坐标为节点数，纵坐标为基因symbol。见图3。

图2 薄荷靶点蛋白相互作用网络图

图3 蛋白互作核心基因柱状图

3.3 “薄荷-有效活性成分-交集治疗靶点-疾病”网络图应用Cytoscape软件构建薄荷治疗慢性胆囊炎的药物-有效活性成分-交集治疗靶点-疾病相互作用网络图，从而间接体现了胆舒胶囊治疗慢性胆囊炎多组分、多靶点协同作用的特点。见图4。

图4 薄荷-有效活性成分-交集治疗靶点-疾病相互作用网络图

3.4 GO富集分析采用UniProt数据库对基因symbol进行ID转换，依托Bioconductor数据库，运用R语言软件及clusterProfiler等数据包，设置pvalueCutoff与qvalueCutoff的值为0.05，从生物进程、分子功能、细胞成分3个水平对36个关键靶点进行分类富集分析，GO富集结果包括细胞对氧化的应激反应、对金属离子的响应、正向调节平滑肌细胞的增殖、胶原代谢过程等生物进程；蛋白磷酸酶、丝氨酸水解酶活性、过氧化酶活性等分子功能；膜筏、膜微结构域、肥大细胞颗粒等细胞成分。

3.5 KEGG富集分析利用上述的基因ID，同样依托Bioconductor数据库，利用R语言软件及clusterProfiler等数据包，设置pvalueCutoff与qvalueCutoff的值为0.05进行KEGG信号通路分析，包括癌症通路、TNF信号通路、Relaxin信号通路、磷酸酯酶D信号通路、VGEF信号通路、缺氧诱导因子1信号通路等代谢通路。取排名前20的KEGG信号通路绘制高级气泡图。见图6。

图6 KEGG通路富集分析高级气泡图

4 讨论

网络药理学对药物治疗疾病的靶点、通路等可以从分子水平上预测，故本文通过该策略研讨胆舒胶囊医治慢性胆囊炎的分子机制，结果获得12个主要活性成分，分别为金柑苷、金合欢素、蒙花苷、豆甾醇、谷甾醇、柚皮素、圣草酚、芫花素、木犀草素、L-薄荷酮、L-薄荷醇、胡椒酮。现阶段发现金合欢素具备多重生物活性，如抑菌、抗炎、抗癌、抗氧化、免疫调节等效用[4]。蒙花苷可以通过调节炎性因子与炎性介质的水平而产生抗炎镇痛作用[5]。谷甾醇的抗炎机制可能是通过抑制炎症介质PGE2、缓激肽、组胺、5-HT等的活性来抑制游离细胞的迁移[6]。豆甾醇和圣草酚具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症等药理活性。L-薄荷酮、L-薄荷醇、胡椒酮为薄荷挥发油中含量高的主要成分，它们可通过干预消化道钙离子的跨膜运动产生解痉、使消化道平滑肌松弛，形成利胆作用[7]。周露[8]的研究表明薄荷挥发油具有显著的抗大肠埃希氏菌、嗜肉菌、白假丝酵母菌等菌株活性。

药物与疾病的交集靶点36个，包括VEGFA、AKT1、EGFR、TNF、MAPK3、PTGS2、MMP9、MMP2、MPO、HIF1A等，主要涉及血管生成、炎症反应、癌症进展、细胞凋亡及氧化应激等生理病理进程。在VEGFRA-VEGFR2信号蛋白通路中，PI3K下游信号的AKT激活后，通过下游的Bad、mTORC1、FOXO、GSK-3β、eNOS等靶分子调节细胞凋亡和血管通透性、参与血管生成和浸润转移相关的炎症反应。表皮生长因子受体(EGFR)是影响局部上皮组织新生血管修复和内皮细胞形成的重要因素，其可以参与癌症、炎症、免疫疾病的进展。EGFR是EGF与TGF-α受体；同时，相关研究表明，EGFR可导致胆固醇核化过程异常，促使胆结石的形成[9]。因此，我们推测，薄荷中的有效活性成分可与EGFR相互作用，阻断促炎因子与EGFR结合，起到抗炎作用，同时抑制胆结石的形成。肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)是一类可诱导细胞凋亡的因子，可由多种细胞分泌表达，其生物学功能主要包括细胞凋亡、诱导炎症反应和免疫调节等。TNF-α细胞因子处于家族中最重要的地位，主要通过对MAPK、NF-κB、ERK等信号通路的上调，起诱导细胞凋亡和促炎作用[10]。MAPK靶点同样与肿瘤、炎症、氧化应激密切相关[11]，磷酸化的p38MAPK可激活许多底物如转录因子、胞浆与胞核内蛋白、蛋白激酶等，诱导炎症反应、细胞的分化、周期停滞、衰老、凋亡、细胞因子的产生和RNA剪接的调控等，且这种活化作用通常具有组织细胞特异性。前列腺素内过氧化物合酶(PTGS2)作为环氧酶途径中的双功能酶，作为前列腺素中氧化酶的还原酶，具备COX与过氧化酶活性，可将花生四烯酸催化成前列腺素，推测薄荷活性成分可能通过抑制PTGS2以达到抗炎、镇痛效果。MMPs是肽链内切酶，它能够降解细胞外基(ECM)的组成成分，MMP9、MMP2可促成肿瘤新生血管的形成，导致血管局部基底膜降解，创造促进血管生成，促进肿瘤细胞侵袭转移的微环境[12]。髓系细胞中的髓过氧化物酶(MPO)遇到病原体后，骨髓细胞可以产生过量的H2O2，MPO与H2O2等氧化剂发生过氧化反应和正卤化反应，产生杀菌能力很强的次氯酸(HClO)，可引起蛋白质破裂、DNA变性和氨基酸分解等病理过程[13]。缺氧诱导因子1(HIF-1)作为一种由机体在缺氧时产生的依赖氧的转录激活物,诱导VEGF、促炎黏附分子和趋化因子的表达，调节机体适应缺氧环境。

经过GO及KEGG富集结果分析可知，GO富集分析发现关键靶点参与细胞的氧化应激反应、金属离子的响应、正向调节平滑肌细胞的增殖、胶原代谢过程等生物进程；蛋白磷酸酶、丝氨酸水解酶活性、过氧化酶活性等分子功能；膜筏、膜微结构域、肥大细胞颗粒等细胞成分。KEGG富集分析提示胆舒胶囊主要是通过癌症、TNF、Relaxin、磷酸酯酶D、VEGF、HIF-1等信号通路发挥协同作用。HIF-1通路水平的变化与AKT，NF-κB通路有关，还可诱导VEGF的转录，为干预炎症损伤、氧化应激、凋亡、肿瘤的重要信号通路[14]。薄荷活性成分可通过Relaxin信号通路发挥抗炎作用：relaxin-2可以抑制 TNF-α诱导的单核细胞对血管内皮细胞的粘附[15]。

综上所述，本文初次运用网络药理学的策略研究胆舒胶囊医治慢性胆囊炎分子机制，提示其可能通过抗炎镇痛、解痉、利胆、抗菌等方面来治疗慢性胆囊炎；成功地预测了胆舒胶囊治疗慢性胆囊炎主要作用的靶点与相关的信号通路，发现胆舒胶囊经过多组分-多靶点-多通路发挥医治作用，为后续的实验研究等提供参考。