抑郁症小鼠海马组织差异表达炎症因子基因筛选及生物信息学分析

邵青，袁东亮，王娜，阎得胜，张晓红，张辉，权伟

1 西安市精神卫生中心，西安710199；2 空军军医大学；3 空军军医大学唐都医院

抑郁症是一组症状群，包括情绪及情感紊乱，快感缺乏和精神运动症状，其发生发展机制复杂，具体分子机制仍不明确。既往对于抑郁症的机制研究主要涉及下丘脑—垂体—肾上腺轴［1］、神经递质系统［2］、神经营养因子［3］、神经可塑性过程［4］、神经免疫轴［5］及神经炎症趋化因子［6］等。大量研究证实，炎症紊乱是抑郁症发病的免疫学基础，也是抑郁症免疫病理的主要特征［7］。越来越多的基础研究结果也支持抑郁症患者存在神经炎症的特征性改变，主要表现为小胶质细胞激活，可伴有星形胶质细胞激活、趋化因子水平改变等［8］。有研究报道，抑郁症患者神经炎症与C 反应蛋白（CRP）、白细胞介素（IL）6 等有关［9］，但都缺乏确凿的证据。2018 年1 月—2019 年12 月，本研究应用炎症细胞因子与受体PCR 芯片，观察小鼠海马组织中84 个炎症因子基因的差异表达情况，对差异表达基因进行生物信息学分析，为深入探讨抑郁症发病的炎症机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要材料 C57小鼠12只，体质量23～25 g，雄性，由空军军医大学实验动物中心提供，使用许可证号为SCXK（陕）2014-001，生产许可证号为SCXK（陕）2014-002。PCR 仪（PTC-100）购自MJ公司。杂交炉（G2545A）、芯片扫描仪（G2565BA）购自Agilent 公司。分光光度计（ND1000）购自Nano⁃drop 公司。TRIzol 试剂购自Invitrogen 公司。氯仿、异丙醇及乙醇购自上海化学试剂有限公司。无RNA酶的水/糖原购自Ambion公司。

1.2 抑郁症模型制作及海马组织获取 将12 只小鼠分为对照组和抑郁症组，每组6 只。抑郁症组参照ADZIC 等［12］的方法，通过慢性不可预知温和应激模型（CUMS）制备小鼠抑郁症模型，配合孤养。应激处理的多变性及不可预测性是模型制备成功的关键。对照组不造模。造模结束后，将两组小鼠麻醉，断头取脑，剥开新鲜的脑膜后立即获取皮层和海马组织，用镊子直接夹取海马核团，放入液氮保存。

1.3 海马组织中炎症因子基因检测及差异表达基因筛选 海马组织匀浆，匀浆后加入TRIzol 试剂提取RNA。DNase Ⅰ消化RNA 样品，去除其中可能含有的基因组DNA，对RNA进行纯度和质量检测。随后进行cDNA 合成及实时定量PCR 反应。检测84个炎症因子基因（见表1），得到原始基因表达数据集。采用GeneSpring GX11.5.1 软件分析基因芯片数据，获取两样本信号强度比值（Cy3/Cy5，Ratio），将Ratio＞2 或＜0.5 作为有表达差异，＞2 为表达下调、＜0.5为表达上调。Volcano Plot 筛选差异表达基因，以log2|Fold Change|＞2 及校正P＜0.05 者作为差异表达基因。

1.4 差异表达炎症因子基因的生物信息学分析基于KEGG 数据库和Reactom 数据库，使用Topp⁃gene（https：//toppgene.cchmc.org/）在线工具对差异基因进行联合通路富集分析；基于GO 数据库，使用R 软件包clusterProfiler3.8.1 对差异表达基因进行GO生物过程（GO-BP）的富集分析，在结果筛选时使用BH 校正并筛选错误发现率（FDR），以FDR＜0.05的富集功能项作为最后结果。

1.5 目标差异表达基因筛选 通过对GO-BP 分析及KEGG 通路分析结果进行交集，筛选目标差异表达基因。

表1 待检小鼠炎症因子基因种类

2 结果

2.1 两组炎症因子基因表达情况 与对照组相比，抑郁症组中差异表达的细胞因子基因有6 个，表达上调的3个基因分别为CXCL5、BMP2、IL10RA，表达下调的3个基因分别为CCL12、IL5、IL1A。

2.2 GO-BP分析结果 GO-BP分析结果显示，差异表达基因主要参与白细胞迁移、白细胞趋化性及免疫系统过程等生物过程的调控。见表2。

表2 差异表达基因GO-BP富集分析结果

2.3 KEGG通路分析结果 KEGG通路分析结果显示，差异表达基因主要参与细胞因子与细胞因子受体相互作用通路、趋化因子信号转导通路及IL-17信号转导通路等信号通路。见表3。

表3 差异表达基因KEGG通路分析结果

2.4 目标差异表达基因筛选结果 通过对GO-BP分析及KEGG 通路分析结果进行交集，筛选出4 个目标差异表达基因，为CXCL5、BMP2、IL1A、CCL12基因（倍数变化分别为2.68、2.21、0.47、0.36）。

3 讨论

传统观念认为，由于血脑屏障的存在，中枢神经系统通常被视为“免疫豁免区”，但这一观念在逐渐改变，因在中枢神经系统内也可出现炎症介质水平增高［10］。研究发现，神经炎症假说在抑郁症病理机制中具有重要作用［11］。上述观点亦通过脑影像学技术如正电子发射体层摄影（PET）得到验证［12］。抑郁症为炎症因子紊乱，即促炎因子和抑制炎症的因子都可能增加，这一特点与其他炎症性疾病有所不同［13］。对抑郁症神经炎症的相关分子机制进行研究，有助于为未来开展抑郁症的免疫靶向治疗提供参考。

本研究采用的QIAGEN PCR 芯片具有两个特点［14］：一是免除引物设计合成和PCR 条件的摸索，二是无需检索文献或前期的实验验证。小鼠炎症因子与受体芯片包含84 个炎症因子相关基因。涵盖了趋化因子及其受体基因、IL 及其受体基因等。基因芯片结果显示，抑郁症组与对照组相比，表达差异的炎症因子基因有6个，表达上调和下调的基因各3个。在抑郁症的发病过程中有多个炎症相关过程参与，它们涉及到白细胞迁移、白细胞趋化性及免疫系统等生物过程，也涉及细胞因子与细胞因子受体相互作用通路、趋化因子信号转导通路及IL-17信号转导通路等。这些结果再次证实了抑郁症中多个炎症相关基因改变的多样性［15］。本研究共筛选出4个目标差异表达基因，分别为CXCL5、BMP2、IL1A、CCL12基因。推测它们与抑郁症的炎症作用机制高度相关，是引起本实验中小鼠抑郁症的主要差异靶基因，但具体调控机制还需进一步研究。

在4 个目标基因中，CXCL5 基因表达差异最为明显。CXCL5 基因位于4 号染色体q13.3，编码CX⁃CL5蛋白［16］。CXCL5为趋化因子CXC家族一员。趋化因子是一类小分子碱性蛋白，主要功能是趋化细胞定向移动。大多数的趋化因子属于CC 和CXC 两个亚族。CXC 亚族有17 个成员（CXCL1-17），CXC亚族主要作用于中性粒细胞，这个亚族中比较重要的趋化因子有IL-8（CXCL8）、γ干扰素诱生的单核因子（Mig/CXCL9）、γ 干扰素诱生蛋白10（IP-10/CX⁃CL10）、基质细胞来源因子1（SDF-1/CXCL12）等［17］。CXCL5 主要表达于中性粒细胞、单核细胞，也能表达于嗜酸性粒细胞。中性粒细胞是先天性免疫监视的重要组成部分，同时在炎症导致的病理损伤中发挥重要作用［18］。有文献显示，CXCL5 信号通路与神经炎症及血脑屏障损伤相关，并可导致脑白质损伤［19］。另有学者发现，CXCL5 与创伤性脑损伤［20］、人脑内皮屏障破坏［21］等相关。CXCL5 与抑郁症的关系及其中相关机制还需要进一步验证。