雷公藤红素对前脂肪细胞3T3-L1 成脂分化的抑制作用及其机制

刘旭，杨胜荣，王希敏

天津市南开医院，天津300010

2 型糖尿病（T2DM）发病率呈逐年升高趋势，我国目前有超过1 亿的成年糖尿病患者［1］。90% 以上的T2DM 患者均存在胰岛素抵抗（IR），同时伴或不伴有胰岛素相对分泌不足。发生IR的T2DM患者体内正常胰岛素浓度的生物学效应低于正常，究其原因是胰岛素靶组织对胰岛素的敏感性和反应性降低。临床治疗糖尿病大多立足于改善胰岛素敏感性。肥胖是IR 发生的最主要因素［2］。CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）、过氧化物酶体增殖物激活受体g2（PPARg2）和脂肪酸蛋白4（FABP4）是脂肪生成相关蛋白，这些蛋白表达增加可以明显增强脂肪细胞的成脂分化。在脂肪细胞中，胰岛素通过磷酸化胰岛素受体来激活胰岛素受体底物（IRS），磷酸化的IRS 结合磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的调节亚基p85，进而激活催化亚基p110 来活化丝/苏氨酸蛋白激酶（AKT）信号通路，刺激葡萄糖转运蛋白4 从细胞质转位至细胞膜，促进各个组织的葡萄糖摄取及利用［3-4］。雷公藤红素来源于中药雷公藤根皮，是一种具有多种天然活性的醌甲基三萜，是雷公藤片和雷公藤多苷片等制剂的有效成分之一。雷公藤红素已用于多种疾病的治疗，其药理作用除了抗炎、抗肿瘤外，还有抗糖尿病和肥胖的作用［5-11］。在高脂饮食诱导的肥胖鼠模型中，雷公藤红素能够减少鼠进食量，增加能量消耗，发挥强效减轻体质量效果。但雷公藤红素与脂肪分化之间的关系尚未见报道。2018年10月—2019年11月，本研究以前脂肪细胞3T3-L1为模型，观察了雷公藤红素对成脂分化的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 前脂肪细胞3T3-L1 接种于含10% FBS、200 U/mL 青霉素、200 U/mL 链霉素的DMEM 培养基中，放于37 ℃、5% CO2加湿培养箱中培养。雷公藤红素购自上海诗丹德生物公司，纯度＞98%。FBS 和DMEM 培养基购自美国HyClone公司。CCK-8 试剂盒购自碧云天生物技术研究所。TRIzol 购自美国Invitrogen 公司。逆转录试剂盒、PCR试剂盒购于北京全式金生物公司。PCR引物购自北京擎科新业生物技术有限公司。C/EBPα 抗体、FABP4 抗体、PPARg2 抗体、PTPN11 抗体均购于美国Proteintech 公司。HRP 标记的羊抗兔二抗购自三箭生物技术公司。

1.2 3T3-L1 细胞成脂分化诱导及雷公藤红素作用浓度筛选 1.2.1 成脂分化诱导 在37 ℃、5% CO2的湿润环境中，3T3-L1 细胞在脂肪细胞诱导培养基（含10%FBS、0.5 µmol/L 地塞米松、0.25 mmol/L 甲基异丁基黄嘌呤、5 µg/mL胰岛素和50 µmol/L吲哚美辛的α-MEM培养基）中培养3 d达到约90%融合。

1.2.2 雷公藤红素作用浓度筛选 雷公藤红素用DMSO 配置成50 mmol/L 备用。将3T3-L1 细胞以3×103/孔接种到96 孔板中，在脂肪细胞诱导培养基中培养，分别给予0、0.2、0.3、0.4、0.5 µmol/L 的雷公藤红素于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养48 h。将CCK-8试剂添加到每个孔中，37 ℃下培养2 h。用多功能酶标仪于450 nm 波长处检测吸光度值。小剂量雷公藤红素对细胞增殖能力无明显影响，0.3µmol/L 以上剂量的雷公藤红素作用后细胞增殖能力明显减弱。选择0.3 µmol/L剂量用于后续实验。

1.3 雷公藤红素作用后3T3-L1细胞中脂质检测 3T3-L1 细胞在脂肪细胞诱导培养基中培养达到90% 融合后，分别给予0、0.3 µmol/L 的雷公藤红素处理3 d。用冷PBS 将处理过的细胞轻轻清洗2 次，在室温下于4%多聚甲醛中固定10 min。随后，细胞用去离子水洗涤2 次，并在室温下用60% 饱和油红O 染色5 min。每孔加入4% 异丙醇，在振动摇床上摇动15 min，520 nm 波长下测定提取染料光吸收率反映细胞内油红O含量。

1.4 雷公藤红素作用的3T3-L1 细胞中脂肪生成相关基因检测 3T3-L1 细胞培养及处理方法同“1.3”。用TRIzol 试剂提取细胞总RNA，然后用逆转录试剂盒将每个样本的RNA 1 µg 逆转录成cD⁃NA，逆转录条件为25 ℃10 min，37 ℃1 h，85 ℃2 min。应用SGExcel Fast SYBR Mixture kits 进行qP⁃CR 检测。95 ℃预变性2 min，95 ℃10 s、60 ℃10 s、72 ℃10 s，共40 个循环。以β-tubulin 为内参。C/EBPα 上游引物序列为5′-CTGATTCTTGCCAAACT⁃GAG-3′，下 游 引 物 序 列 为5′-GAGGAAGCTA⁃AGACCCACTAC-3′；PPARγ上游引物序列为5′-CTT⁃GACAGGAAAGACAACGG-3′，下游引物序列为5′-GCTTCTACGGATCGAAACTG-3′；FABP4上游引物序列为5′-AAATCACCGCAGACGACAGG-3′，下游引物序 列 为5′-GGCTCATGCCCTTTCATAAAC-3′。 以2－ΔΔCt表示目的基因相对表达量。

1.5 雷公藤红素作用的3T3-L1 细胞中脂肪生成相关蛋白检测 3T3-L1 细胞培养及处理方法同“1.3”。处理后的细胞用RIPA 裂解液裂解，应用BCA 蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度。每组取20 µg蛋白样本行12% SDS-PAGE 电泳，PVDF转膜；5% 脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入一抗tubulin 抗体（1∶2 000）、C/EBPα 抗体（1∶1 000）、FABP4 抗体（1∶1 000）、PPARγ 抗体（1∶1 000）于4 ℃孵育过夜；PBST 洗膜后，加入二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，PBST 洗膜后用ECL 化学发光法染色；Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.6 雷公藤红素作用靶点预测及验证 利用在线药物靶点预测软件Swiss Target Predication 分析雷公藤红素的潜在作用靶点。3T3-L1 细胞培养及处理方法同“1.3”。分别采用RT-PCR 法和Western blot⁃ting法检测预测靶点基因和蛋白表达。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey 或Dunnett 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雷公藤红素作用的3T3-L1 细胞中脂质积累情况 0、0.3 µmol/L的雷公藤红素处理3 d后，3T3-L1细胞中脂质累积分别为97.33% ± 1.45%、33.33%± 3.48%，雷公藤红素处理后细胞中脂质累积减少（P均＜0.01）。见图1。

图1 不同浓度雷公藤红素作用的3T3-L1细胞中脂质积累情况

2.2 雷公藤红素对3T3-L1 细胞脂肪生成相关基因及蛋白表达的影响 0.3 µmol/L 雷公藤红素作用后，3T3-L1 细胞中C/EBPα、PPARg2、FABP4 mRNA及蛋白相对表达量均降低（P均＜0.05）。见表1。

表1 不同浓度雷公藤红素作用后3T3-L1细胞脂肪生成相关基因及蛋白表达比较（）

表1 不同浓度雷公藤红素作用后3T3-L1细胞脂肪生成相关基因及蛋白表达比较（）

注：与0 µmol/L组相比，*P＜0.05。

浓度0 µmol/L 0.3 µmol/L C/EBPα mRNA 1.229 ± 0.229 0.175 ± 0.071*蛋白1.107 ± 0.056 0.432 ± 0.028*蛋白1.145 ± 0.022 0.239 ± 0.071*PPARg2 mRNA 1.151 ± 0.115 0.299 ± 0.035*蛋白1.054 ± 0.026 0.591 ± 0.030*FABP4 mRNA 0.887 ± 0.113 0.151 ± 0.063*

2.3 雷公藤红素药物作用靶点预测及验证情况雷公藤红素药物作用靶点主要与酶（20.0%）、核受体（20.0%）、磷酸酶（13.3%）、TLR-1 和IL-1 受体（6.7%）、细胞色素P450（6.7%）等相关。在预测出的30 多种雷公藤红素可能药物靶点中，PTPN11 排名位于前列，提示PTPN11 很可能是雷公藤红素的作用靶点。实验结果显示，0、0.3 µmol/L 雷公藤红素处理的3T3-L1 细胞中PTPN11 mRNA 相对表达量分别为1.079 ± 0.079、0.375 ± 0.029，PTPN11 蛋白相对表达量分别为1.128 ± 0.064、0.669 ± 0.084。雷公藤红素作用于3T3-L1 细胞后，PTPN11 mRNA及蛋白表达均下调（P均＜0.05）。

3 讨论

雷公藤红素作为一种传统中药，也已被用于糖尿病和肥胖的治疗［15］。文献报道，雷公藤红素可通过抑制NF-κB信号通路激活来减少前脂肪细胞3T3-L1 中活性氧生成，提高线粒体膜电位［16-17］。雷公藤红素可通过激活PI3K/Akt 通路来增加胰岛素信号通路活性［18］。雷公藤红素还有助于增加高脂膳食诱导的肥胖小鼠对瘦素的敏感性。还有研究认为，雷公藤红素能够减少摄食量、增加能量消耗，从而发挥强效减重作用［15］。胰岛β 细胞功能障碍是T2DM 决定性的发病因素。雷公藤红素可以直接作用于胰岛β 细胞，抑制胰岛β 细胞凋亡［19］。但是，雷公藤红素对成脂分化的调控作用尚未见研究报道。本研究观察了雷公藤红素对前脂肪细胞3T3-L1 成脂分化的影响，并探讨相关机制，进一步探索雷公藤红素在糖尿病治疗中的潜在价值。

脂肪细胞的特征表现之一是脂滴形成。细胞内脂滴大小和数量是评价细胞成脂分化程度的量化指标。本研究油红O 染色结果显示，经不同浓度雷公藤红素作用的3T3-L1 细胞胞质着色比较深，脂滴体积较大，脂滴数目较多，表明各组细胞都出现了成脂分化现象，但雷公藤红素作用组成脂分化能力受到抑制，且抑制程度与雷公藤红素作用浓度相关。这表明，雷公藤红素能够抑制前脂肪细胞的成脂分化。

PPARg2 和C/EBPα 是脂肪细胞分化的两种关键转录因子。其中PPARg 属于核受体超家族成员，是在成脂分化过程中起核心调控作用的特异性转录因子，通过调控C/EBPalpha、FABP4 表达来调节脂肪细胞分化速度和脂滴形成［12］。FABP4 是成熟脂肪细胞胞质蛋白，是反映成脂分化能力的关键指标之一［13-14］。本研究结果显示，0.3 µmol/L 雷公藤红素作用后，3T3-L1 细胞中C/EBPα、PPARg2、FABP4 mRNA 及蛋白相对表达量均降低，进一步表明未经雷公藤红素处理的细胞成脂分化能力最高，而雷公藤红素作用降低了前脂肪细胞的成脂分化能力。

本研究利用在线药物靶点预测软件Swiss Tar⁃get Predication 分析雷公藤红素的潜在作用靶点，结果显示，雷公藤红素药物作用靶点主要与酶、核受体、磷酸酶、TLR-1 和IL-1 受体、细胞色素P450 等相关，PTPN11 可能是雷公藤红素的潜在作用靶点，且雷公藤红素可在mRNA 和蛋白水平降低PTPN11 的表达。研究表明，脂肪组织通过分泌包括瘦素在内的多种脂肪因子来调节细胞能量代谢及生理活动［20］。瘦素是目前研究较为广泛的脂肪因子，其可诱导STAT3 磷酸化并转位至细胞核中，使瘦素靶基因转录，完成瘦素的信号转导。PTPN11基因编码蛋白酪氨酸磷酸酶2（SHP-2），后者参与胞外刺激信号传入胞内的过程，调控Ras/Raf/MAPK、JAK/STAT、ERK 及PI3K 等多种信号转导通路的活化。除了SHP-2广为人知的对肿瘤的调节作用外，SHP-2亦调控肥胖发生。SHP-2可调节瘦素的表达水平，SHP-2基因敲除小鼠的后代即使正常饮食也会比野生型小鼠易于出现早期肥胖。结合文献报道及本研究中雷公藤红素抑制3T3-L1 细胞成脂分化的结果，推测PTPN11 基因编码的SHP-2 很有可能是雷公藤红素抗成脂分化作用的靶点。

综上所述，雷公藤红素可抑制前脂肪细胞3T3-L1 成脂分化，其机制与下调PTPN11 表达、抑制脂肪生成相关蛋白信号通路有关，上述研究结果仍需后续实验进一步证实。