猪克隆技术的研究进展

2021-04-06李兆龙福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州350013

福建畜牧兽医 2021年2期

李兆龙福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州 350013

1 动物克隆技术简介

动物克隆是一种不经过有性生殖过程，生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。到目前为止，已经报道了6 种不同的方法来生产克隆动物[1-2]。

1.1 胚胎分割克隆技术胚胎分割是动物克隆早期的一种技术，它将一个没有着床的早期胚胎运用显微方法一分为二、四或更多，然后将其移植给受体进行分娩（见图1）。通常一个胚胎可以克隆两个以上的后代，且后代的遗传性状完全相同。当前，用胚胎二分法克隆的动物包括鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和马。我国除了马，以上克隆动物都有。该技术较为原始，容易破坏细胞[3-5]。

1.2 胚胎细胞核移植将未植入的早期胚胎细胞（有丝分裂球）通过显微手术分离，然后将其单个胚胎细胞导入去除染色质的未受精成熟卵母细胞。然后采用电融合法充分融合，分化发育成新胚胎。再将新胚胎移植到受体子宫中分娩（见图2）。目前，国外有鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴成功移植。我国也克隆了鼠、兔、山羊、绵羊、猪和牛。这项技术比胚胎分割更进一步，将克隆更多的动物[6-7]。

图1 胚胎分割克隆技术

图2 胚胎细胞核移植

1.3 胚胎干细胞核移植胚胎或胎儿原生细胞被抑制分化后，细胞数量呈指数增长，但细胞没有分化，每个细胞具有发育成个体能力[8]。将单细胞导入成熟的卵母细胞克隆胚胎中，然后移植到受体上，产生妊娠、产仔和克隆出动物（见图3）。胚胎干细胞被引入早期胚胎时，ES 细胞具有多能性的体外增殖能力，并形成嵌合体[9-10]。交配生殖系嵌合体后，可以获得来自ES 细胞的动物[11]。在小鼠中，ES 细胞和基因靶向技术已经成为将期望的遗传变化引入基因组的常规程序[12]。除了鼠之外，还报道了ES 细胞，如仓鼠、兔、鼠、猪、恒河猴、牛和人类[13-14]。有限数量的报告通过在鼠体内产生嵌合体验证了ES 细胞的多能性，但没有证实生殖系嵌合体。因此，目前ES 细胞只能用于克隆动物的产生或小鼠的靶向突变。

图3 胚胎干细胞核移植

1.4 胎儿成纤维细胞核移植孕早期从胎儿中分离出胎儿成纤维细胞，通过核移植，移植受体，妊娠仔猪和克隆个体克隆胚胎（见图4）。英国在1996 年报告克隆了三只山羊[15]。

图4 胎儿成纤维细胞核移植

1.5 体细胞核移植对动物的体细胞进行抑制和休眠，然后通过核移植将去除染色质的成熟卵母细胞导入胚胎，然后移植到受体、妊娠和出生来克隆动物（见图5）。理论上，该方法能不受限制地克隆个体。这一技术的突破在科学和生产应用价值上，可以与原子弹的初始爆炸相当[16]。

1.6 胚胎嵌合将两个胚胎细胞（同种或异种动物胚胎）融合，共同发育成一个称为嵌合胚胎[17]。然后将嵌合胚胎转移到受体妊娠，生产具有上述两种动物胚胎的动物称为嵌合动物（见图6）。嵌合体这个词起源于希腊神话，指的是一头狮子的头，一只羊的身体，还有一条龙的尾巴的怪物。像一只黑老鼠和一只白老鼠的胚胎嵌合体一样，黑白花老鼠诞生了。不同种类的绵羊与山羊胚胎细胞嵌合，可产生绵羊，兼有两种羊的特征。该技术被广泛应用于发育生物学、免疫学和医学动物模型的研究。

图5 体细胞核移植

图6 胚胎嵌合

2 猪的胚胎克隆

2.1 猪克隆技术简介猪的克隆技术不仅有助于提高优势动物的产量，而且也有助于生产具有不含异种移植抗原器官的敲除动物，或分析分离的人类基因的功能。生产克隆猪的策略见图7。目前，猪克隆技术已逐渐从胚胎克隆转移到体细胞克隆，主要包括细胞活化、选择供体细胞、胚胎培养和诱导与维持妊娠等方面：（1）供体细胞的收集。从屠宰场采集的卵巢中可以获得大量的未成熟卵母细胞，通过体外成熟和体外受精获得成熟卵母细胞和胚胎。（2）卵母细胞分离、筛选和去核。威拉德森实验证明，MⅡ阶段成熟卵母细胞比受精卵更适合克隆[18]。因此，所有猪克隆都选择MⅡ期卵母细胞作为核移植受体细胞。通过盲吸、半卵或功能性去核来去除细胞核。（3）核细胞的分离、培养和核提取。猪的核供体细胞可分为胚胎细胞（受精卵)和体细胞(乳腺细胞、耳皮细胞、颗粒细胞等）两类。细胞核通常通过显微手术吸出。（4）胚胎的重建。短时间内吸出供体核，打入受体卵细胞，然后融合重建的胚胎，促进核卵重组。（5）重建胚胎的移植。将重建的胚胎在体外培养一定时间，直到发育到囊胚阶段，然后将其移植到发情母猪的子宫和输卵管中，使母猪怀孕并生产新的克隆个体。

图7 猪克隆技术

2.2 猪克隆研究进展伴随1997 年“多利”羊的诞生，开创了动物克隆的新历史。作为与人类关系密切的猪，自然也引起了科学家研究的兴趣。克隆猪最早报道是在1981 年，Hoppe 等采用显微去核和病毒介导方法，将一个4 细胞期卵裂球的核移入一个去核的卵母细胞中获得克隆猪[11]。 2001 年，澳大利亚科学家在墨尔本一家医院宣布成功培育出澳大利亚第一头克隆猪，同年又培育了一头克隆猪[19]，其GT 基因被成功“关闭”[19]；同年，赖良学采用基因敲除技术先培育出7 头不带“排斥基因”的克隆猪[20]；同年10 月，美国密苏里大学培育出4 头含有荧光水母基因的小猪[21]。 2002 年异种器官移植研究领域的一个重要进展是英国PPL 医疗公司培育出5 头体内有一个基因被关闭的新型转基因克隆猪。 2002 年4 月，美籍华裔杨向中教授和台湾大学教授郑登贵成功将人类第九凝血因子及猪乳铁蛋白基因转入到猪体内，生产出转基因克隆猪[23]；同年7 月，日本研究人员将猪皮细胞的核移植入未受精的卵细胞，电刺激融合，移植到子宫，成功培育出一头雌性克隆猪[24]；同年8 月，韩国研究人员采用体细胞克隆方法生产出5 头雌性小猪[25]。 2003 年中国台湾的研究人员将成年猪的一个完整细胞植入一个原有遗传物质已经被抽空的受精卵中，成功克隆出4 头小猪。2004年7 月，日本科学家将绿色荧光蛋白质的水母基因植入猪的体细胞中，然后通过体细胞克隆技术，生产出含有水母基因的转基因克隆猪[25]。 2005 年中国农业大学独立自主完成首例体细胞克隆小香猪[26]；2006 年采用体细胞克隆技术成功“克隆”出我国东北民猪[27]。2007 我国运用体细胞克隆技术，成功克隆出医用小型猪。2008 年中国农大试验用同一头母猪作为移植受体克隆出健康欧洲哥廷根小型猪，克隆效率达到了国际先进水平[28]。 2010 年魏红江团队运用体细胞克隆技术获得世界第一头版纳微型猪近交系克隆猪[29]；2014 年，我国又获得世界第一头孤雌生殖克隆猪；2015 年我国与美方合作首次获得了灭活了内源性逆转录病毒的克隆猪。2020 年四川运用体细胞克隆技术获得23 头克隆青峪猪[30]。

2.3 猪的克隆技术

2.3.1 卵母细胞的体外成熟、受精和培养猪的克隆技术主要分为四个步骤，首先是卵母细胞的体外成熟、受精和培养。直到最近，还很难通过体外成熟、受精和培养从未成熟卵母细胞中产生猪囊胚。最突出的障碍之一是通过体外受精获得的正常受精卵母细胞很少。从卵巢卵泡中解放出来的未成熟卵母细胞在培养过程中几乎都能恢复减数分裂，达到中期。虽然成熟的卵母细胞可以通过遗精在体外渗透，但观察到雄性原核形成率低，多精子发生率高。结果表明，猪穿透卵母细胞雄性原核形成的失败可归因于卵母细胞细胞质的不完全成熟，成熟条件得到了改善。用于猪卵母细胞成熟的培养基通常辅以血清，如胎犊血（FCS）、新生小牛血清和猪血清。然而，据报道，FCS 抑制猪卵母细胞在添加FSH 的改良Krebs-Ringer 碳酸氢盐溶液中的成熟，不能改善精子体外穿透后的雄性原核形成。相反，当卵母细胞在猪滤泡液(FF)中成熟时，添加FSH 的卵母细胞在体外受精，81%穿透卵母细胞中的雄性原核表达也表明，在改良的组织培养基-199 中添加10%FCS 或Newborn-仔猪血清似乎不利于细胞质成熟，因为雄性原核形成低于10%PFF 或0.4%聚乙烯醇[31]。

通过控制处理精子和卵母细胞受精的培养基条件，可以降低多精子率。当精子与输卵管细胞预孵育2.5 h 时，多精子率降低，而穿透率没有明显降低。此外，单在精子预孵育过程中，在mTCM-199 中加入0.4%牛血清白蛋白（BSA）可降低多精子症的发生率。最近，据报道，采用改良的Tris 缓冲培养基作为受精培养基，在不预孵化精子的情况下抑制了多精子[32]。

猪囊胚体外产生的另一个问题是受精卵的发育在4 细胞阶段受阻。为了克服这种发育停滞，研究了各种因素对活体受精猪卵母细胞体外发育的影响。草酰乙酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸或乳酸可作为早期卵裂期小鼠胚胎的唯一能源。乳酸和丙酮酸通常包括在培养基中，乳酸被认为是最佳发育所必需的，然而，在猪中，乳酸抑制胚胎发育，胚胎发育不需要乳酸或丙酮酸。在没有乳酸和丙酮酸的情况下，葡萄糖和谷氨酰胺支持胚胎发育到Morula 和囊胚阶段。低牛磺酸或牛磺酸的加入显著改善了体外胚胎发育。基于这些结果，开发了一种指定的NCSU-23 培养基，用于培养猪体内受精胚胎到囊胚期。NCSU-23不仅可用于体外胚胎的培养，还可用于未成熟卵母细胞的体外成熟。添加透明质酸刺激胚泡形成体内受精胚胎和电活化卵母细胞或体外受精胚胎，这些胚胎已在体外成熟。最近，据报道，牛血清白蛋白(BSA)是猪胚胎发育的一个重要因素：本质上不含脂肪酸的BSA 支持发育，但V 级BSA 具有脱胎效应。此外，在晚胚乳期/早期囊胚期添加FCS 刺激囊胚孵化，尽管FCS 对发育有害，直到胚胎到达晚胚/早期囊胚期[33]。

2.3.2 核转移用postembryonic 基因组激活阶段核重组的猪核移植胚胎的体外发育能力非常有限，到目前为止，只有一头仔猪是由于核移植而产生的。仔猪MS 来源于单4 细胞胚体与中期LI 卵母细胞的融合，是88 个已转移的重建胚胎之一。结果表明，猪核移植胚胎由8 至16 个细胞期核重组，成熟卵母细胞在体外裂解的速率为36%～43%，但Morula 期以外的发育速率仅为4.5%～7%。最近报告，28%的核移植胚胎与Morula 期细胞核重组，15%发育形成囊胚，采用预激活卵母细胞作为受体细胞，并在电激活后6 h 诱导囊胚与细胞融合，去除细胞质脂后冷冻保存。

2.3.3 胚胎移植目前，仔猪尚未通过体外从未成熟卵母细胞中产生的囊胚转移获得。当从体内或体外受精卵母细胞体外发育的囊胚被转移到受体雌性中时，从体内受精卵母细胞中获得的胚胎会产生后代，但从体外受精卵母细胞中获得的胚胎的转移并不会导致怀孕。另一方面，研究表明，体外成熟的胚胎和受精的卵母细胞在2 细胞阶段转移到受体时，可以发育成仔猪。这些结果表明，如果体外成熟、受精和培养的任何系统都不完整，卵母细胞/胚胎的活力在所有阶段都会受到影响[34]。当采用体外成熟/受精或体外培养时，胚胎可以在移植后发育成仔猪，因为损伤量相对较小。然而，通过体外成熟、受精和培养产生的胚胎损伤是广泛的，它们不会发育到后代。

2.3.4 孵化囊胚孵化的囊胚衍生细胞与体外成熟卵母细胞融合。一般来说，由平行丝组成的腔室已被用于融合，但该腔室不适合融合孵化的囊胚衍生细胞和去核卵母细胞。相反，当细胞-卵母细胞复合物被夹在排列在一条直线上的电线之间时，融合胚胎的百分比很高（未公布的数据）。在体外培养重建胚胎时，其中一些胚胎被切割并发育到囊胚阶段。在进一步进行的试验中，重建的胚胎被转移到受体实体中，以检查它们发育成后代的能力[35]。

4 存在的问题与不足

虽然猪克隆的意义深远，但其应用研究进展相对缓慢，相关技术仍很不完善。比如体外受精，体外培养体系和体外成熟技术还很不成熟，核分离和卵母细胞去核化水平也有待提高。因为基础理论研究在我国相对薄弱，对一些早期胚胎发生和发育机制缺乏深入了解，此外，对一些基因组重编程的机制尚不清楚，对核移植后基因组重编程的影响也有待进一步阐明。尽管困难和问题较多，但是作为种质资源扩繁和异种移植的巨大前景，仍将激励更多的投入和付出。总之，猪克隆技术将得到进一步改进和发展，基础研究和生产实践的应用将更加广泛。