冬瓜育种基础研究进展

胡阳，蔡美仲，梁红艳，邱文兵，徐清华，李平

（1.荆州农业科学院，湖北，434007；2.石首市天字号瓜蔬土地股份专业合作社）

冬瓜（Benincasa hispidaCogn.，2n=2x=24）属葫芦科冬瓜属一年生蔓生草本植物，起源于中国和东印度，广泛分布于亚洲热带、亚热带及温带地区。冬瓜在我国南北方普遍栽培，我国广东、广西、福建等地以黑皮冬瓜为主，四川、江西、湖南、湖北、安徽等地以粉皮冬瓜为主[1]。节瓜（B. hispidavar.chiehquaHow.）又名毛瓜、北瓜，是冬瓜的一个变种，原产我国南部，为我国的特产蔬菜，主要分布于广东、广西、海南等地，在北方部分地区作为特菜栽培。我国冬瓜和节瓜的遗传育种相关基础研究起步较晚，国内研究机构和人员投入不多，限制了育种技术的提升与产业发展。近年来，随着育种技术和手段的提升，冬瓜的育种也逐步深入，开展了一些分子方面的研究。本文从冬瓜种质资源遗传多样性、抗病育种和主要农艺性状的研究等方面进行了概述，旨在为冬瓜育种提供理论基础。

1 遗传多样性研究

遗传多样性是物种长期进化的产物， 代表不同种质材料间的遗传变异程度， 研究遗传多样性可为物种的分类、进化、遗传改良和良种选育提供理论依据[2]。瓜类作物遗传多样性的研究，如黄瓜[3，4]、南瓜[5，6]、西瓜[7，8]、丝瓜[9]、苦瓜[10，11]、瓠瓜[12]和西葫芦[13]均有报道。

随机扩增多态性DNA （Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）技术因简单、快速、成本低而广泛应用于物种遗传多样性的研究[14，15]。早在1996年，孟祥栋等[16]就利用RAPD 技术对1 份粉皮冬瓜、1 份青皮冬瓜和1 份江心节瓜的资源进行鉴定评价， 发现3 份材料间的遗传相似系数在0.86 以上，3 份材料的亲缘关系很近，但所涉及的冬瓜、节瓜资源和分子标记数量太少。Sureja 等[17]利用RAPD 对9个冬瓜自交系进行遗传分析，发现两两间的遗传距离在0.056～0.179，说明这9个自交系的遗传背景很窄。Verma 等[18]利用RAPD 对10个冬瓜自交系进行遗传多样性分析，发现成对的遗传距离在0.07～0.31， 说明所选10个自交系有广泛的遗传多样性， 但选取的42 对RAPD 标记的多态性比率仅为46%。Pandey 等[19，20]对34 份冬瓜资源通过RAPD 技术聚类分析时发现其遗传相似系数在0.64～0.943，除了IVAG-223 外，其他33 份材料均可归为一大类，且遗传相似系数较高。张建军等[21]利用RAPD 标记对我国的70 份冬瓜资源进行遗传分析， 发现品种资源间的遗传相似系数在0.703～0.986，遗传相似系数较高，说明选取的70 份冬瓜材料遗传背景比较狭窄， 但聚类关系图上不同熟性、皮色的冬瓜聚在一起， 说明选取的11 对RAPD 标记与农艺性状不相关。宋世威等[22]利用RAPD 分子标记技术对41 份冬瓜和节瓜种质资源进行遗传多样性分析， 种质间的遗传相似系数在0.60～0.99，冬瓜和节瓜没有聚成两大类，而是交叉地分散到六大类群中，表明冬瓜和节瓜的亲缘关系很近，分子水平上证明其属于同一个种的不同变种。冬瓜各品种的相似系数多集中在0.60～0.80，而节瓜各品种的相似系数多集中在0.80～0.99，表明冬瓜的遗传多样性大于节瓜，节瓜的遗传背景比冬瓜更狭窄。江彪等[23]利用简单序列重复区间标记技术 （Inter-simple sequence repeat，ISSR） 对57 份冬瓜资源进行聚类分析， 结果表明，57 份冬瓜种质间的遗传相似系数在0.26～1.00， 大部分在0.70 以上， 表明供试的57份材料间遗传基础狭窄。乔燕春等[24]利用相关序列扩增多态性 （Sequence related amplified polymorphism，SRAP）分子标记技术对38 份节瓜、冬瓜材料进行遗传聚类分析发现， 遗传相似系数在0.95～0.99，节瓜和冬瓜的遗传背景非常窄，冬瓜与黄毛型节瓜的亲缘关系近于与普通类型节瓜。王鹏等[25]利用ISSR对36 份节瓜自交系进行遗传多样性分析， 结果表明，36 份材料间遗传相似系数在0.57～0.96，表明材料间遗传多样性较为狭窄。焦贤贤等[26]利用SSR 标记对111 份冬瓜种质资源进行遗传多样性分析，多态率92.86%， 聚类分析发现在遗传距离为0.70 的位置可将这些种质分为6个类群， 其中相同果形、籽 形 的 种 质 资 源 间 亲 缘 关 系 较 近 。

利用RAPD、SRAP 和ISSR 等分子技术对冬瓜及其变种节瓜的亲缘关系研究发现大部分材料间的遗传背景较窄，仅有少部分材料遗传相似系数较低[18～20]。冬瓜和节瓜资源从瓜形、瓜色、大小等方面差别很大，但通过遗传多样性分析发现其遗传背景较窄，如何对冬瓜和节瓜进行遗传分类、确定其亲缘关系，还需要基因等方面的数据进一步证实。同时，遗传多样性的分析有利于国内冬瓜、节瓜资源的杂优利用，通过发掘冬瓜属野生资源扩大冬瓜属植物的遗传类型，同时利用生物技术手段开发分子标记，对冬瓜育种和遗传改良提供理论基础。

2 抗病性研究

冬瓜的常见病害种类有枯萎病（Fusarium wilt）、病毒病（Viral disease）、疫病（Phytophthora blight wilt）等，严重影响冬瓜的产量、品质，特别是南方地区高温多雨，发病更加严重，选育多抗材料是冬瓜抗病育种亟需解决的问题[27]。近年来对于冬瓜的抗病性研究从病原菌鉴定[28～33]、抗病种质资源的筛选[27，33，34]、抗性分子标记的筛选[31，35]和抗病基因的同源克隆[36～39]逐步深入开展，取得了一定的成果。

由于冬瓜的遗传背景狭窄，可利用的相关分子标记较少，因而通过传统的图位克隆或转座子标签法获得抗病基因（R基因）难度较大[37]，但R基因表达产物存在许多高度保守的区域，如核苷酸结合位点和富亮氨酸重复序列（Nucleotide binding site and leucine rich repeat，NBS-LRR）、丝氨酸-苏氨酸激酶结构 （Ser/Thr-kinase，STK）、 蛋白激酶类（Protein kinase，PK）等[40，41]。鉴于抗病基因同源序列可能为R基因一部分或与R基因紧密连锁，因此根据这些抗病基因的保守序列设计引物，PCR 扩增同源序列，成为克隆该类抗病基因的有效途径。目前，利用同源克隆法已从许多瓜类作物中分离了抗病基因同源序列（Resistance gene analogue，RGA），如黄瓜[42]、南瓜[43]、西瓜[44]、瓠瓜[45]等。

谢大森等[35]利用随机扩增微卫星多态性（Random amplified microsatellite polymorphism，RAMP）标记技术，获得了与冬瓜抗枯萎病材料B94抗性连锁的分子标记CGA-6380，CGA-6380 与抗性基因的遗传距离为5.2 cM，分子和人工鉴定表明CGA-6380 标记适宜筛选携带有抗枯萎病基因材料B94。赵芹等[37]利用黑皮冬瓜B98K 为试材，根据已克隆的植物NBS 类抗病基因保守结构域设计简并引物，得到19 条抗病同源序列，同源进化分析将其全部归为non TIR-NBS-LRR 类。刘文睿等[38]利用NBS 类抗病基因保守结构域设计简并引物，从冬瓜抗病材料B227 基因组中分离获得32 条特异抗病基因同源序列，其中17 条具有完整开放阅读框，序列相似性分析结果表明， 这17 条序列均包含Ploop、Kinase-2 和GLPL 等保守结构域， 属于TIRNBS-LRR 类抗病基因。

由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的枯萎病是节瓜的重要病害。1994年，Ishiguro 等[46]从甘薯中克隆得到第1个WRKY转录因子SPF1。WRKY转录因子在植物抗逆过程中起到重要的作用，张金平[36]克隆获得了节瓜的第1个WRKY基因CqWRKY1，CqWRKY1在镰刀菌酸毒素胁迫下被强烈诱导表达，此外CqWRKY1表达受信号分子水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）诱导，由此可见判定CqWRKY1转录因子参与枯萎病防御反应的调控。赵芹等[47]在节瓜抗镰刀菌酸突变体LT3 的基因组中分离克隆了22 条NBS 抗病同源序列， 均为non TIR-NBS-LRR 类。Mao 等[39]利用cDNA 末端快速扩增技术 （Rapid amplification of cDNA ends，RACE）和同源克隆技术克隆了10个WRKY基因，在镰刀菌酸毒素胁迫下发现4个基因的表达在抗感病节瓜品种中存在差异，其中CqWRKY31为正调节子，CqWRKY1、CqWRKY23和CqWRKY53为负调节子。

3 遗传图谱构建及基因组测序

遗传图谱构建是分子育种的基础。早期，利用同工酶、RAPD 与AFLP 等标记构建遗传图谱，图谱标记稀少，性状与标记连锁不紧密。高通量测序技术发展为高密度遗传图谱构建带来了方便，其中简化基因组测序技术是一项快速、成本较低的高通量测 序 技 术。SLAF-seq （Specific-locus amplified fragment sequencing）简化基因组测序技术结合了位点特异性扩增和高通量测序，可以用于全基因组范围的SNP 开发和大范围的基因分型。Jiang 等[48]利用SLAF-seq 技术对冬瓜进行了全基因组测序，测序包含2个亲本和140个F2代单株，挑选了4607个多态性SNP， 构建了包含12 条连锁群的高密度遗传图谱，平均每条连锁群上包含384个SLAF标记， 总图距为2172.86 cM， 标记间平均距离为0.49 cM。这是在冬瓜上首次构建的高密度遗传图谱，可用于基因定位、分子标记辅助育种和基于图谱的基因克隆等工作。冬瓜的全基因组测序工作开展较晚，2019年对冬瓜开展全基因组从头测序工作[49]，组装的冬瓜基因组大小为913 Mb，其中859 Mb锚定到12个连锁群，预测总共有689.5 Mb 的重复序列和27467个编码蛋白质的基因。同时分析了146 份冬瓜资源， 构建了1 张包括1600万个SNP位点的全基因组遗传图谱。通过对瓜类作物的比较分析发现，冬瓜是所有已知瓜类作物中保留最多祖先基因状态的作物， 并推断所有瓜类作物起源于1个拥有15 条染色体的祖先基因组。

4 果皮颜色及蜡粉研究

蔬菜作物的果皮颜色主要取决于果实发育阶段、成熟度、色素同分异构体的种类和数量等[50]，同时也受外界环境的影响，如栽培管理、植株朝向、是否遮荫等。果皮颜色不仅是衡量果实发育和成熟状态的重要标志，也是外观品质的重要性状之一[51]。对果皮颜色进行遗传和分子研究是冬瓜育种多元化发展的必要，也是满足消费者和市场多样性的需求。冬瓜根据果实表皮颜色和被蜡粉与否可分为青皮冬瓜和白皮（粉皮）冬瓜，肉色有白、淡绿和青绿，果皮有黑色、深绿色、绿色和黄色。节瓜根据果皮颜色主要分为墨绿、青绿和白等几种类型。

4.1 冬瓜果皮颜色研究

对冬瓜的蜡粉性状进行遗传研究， 发现粉皮对青皮为显性，即有蜡粉对无蜡粉为显性，这和黄瓜[52，53]、大白菜[54]、甘蓝[55，56]、红菜薹[57]等蔬菜作物中发现的蜡粉性状遗传模式相似。粉皮冬瓜与非粉皮冬瓜亲本所配组合，F1代均为粉皮，但F1代的蜡粉厚度和均匀度有所差异， 这可能是有或多蜡粉对无蜡粉表现部分显性，也可能是受细胞质中DNA 的影响。

前人曾对苦瓜[58]、黄瓜[59，60]、西葫芦[61]等 的果皮颜色遗传规律进行研究，认为遗传规律有单基因控制的，也有多基因控制的。对青皮冬瓜果皮研究发现，绿皮对黄皮为显性[62，63]，且绿皮和黄皮受1 对显性核基因控制，刘文睿等[63]将控制冬瓜墨绿色果皮颜色基因定位在LG4 连锁群，与目的基因连锁的标记是M14OD24，连锁距离为4.5 cM。Jiang 等[48]利用SLAF-seq 技术构建了冬瓜的高密度遗传图谱，利用六世代群体对冬瓜果皮颜色分析，发现冬瓜果皮颜色是由单基因控制的性状， 深绿对黄色为显性。基于高密度遗传图谱和表型数据，定位到1个与果皮颜色相关的QTL 区间，位于LG5 连锁群上35.6 cM 的区间范围内， 连锁的2个标记分别是Marker44050 和Marker53003， 遗传距离为1.0 cM和1.9 cM，表型贡献率分别为82.66%和71.97%。

4.2 节瓜果皮颜色研究

对节瓜果皮披蜡粉性状遗传分析，发现蜡粉有无受1 对核基因控制， 有蜡粉对无蜡粉表现为显性[64]。对节瓜果皮颜色进行遗传研究，发现果皮深绿色与青绿色受1 对核基因控制，深绿色对青绿色为显性[65]。黎炎等[66]研究发现，节瓜果皮蜡粉和颜色的遗传规律一致，正反交F1代均偏向有蜡粉的亲本和深绿色的亲本， 但蜡粉的厚度和颜色的深浅有差别， 因此果皮蜡粉和颜色性状除受2个主基因控制外，可能存在与之相关的修饰基因。朱冬冬等[67]利用群 体 分 离 分 析 法 （Bulked segregation analysis，BSA），在100 对ISSR 标记中筛选出与节瓜墨绿色果皮基因连锁的标记G855-6，其交换值为8.95%，遗传距离为9.04 cM。

5 其他农艺性状研究

冬瓜早熟性的主要构成因素有初花出现所需天数、第一雌花着生节位、果实发育速率等[68]。于远等[69]对节瓜始雌花节位研究发现，其遗传是由主基因和多基因控制的数量性状，早熟性可以通过杂种优势来实现。谢大森等[70]对5个节瓜材料的7个产量相关性状（单瓜质量、瓜长、肉厚、雌性率、早熟性、病毒病抗性、瓜形指数）进行了遗传分析，研究发现这7个性状遗传均属于加性-显性模式。谢大森等[71]对56个冬瓜品种的13个性状进行了遗传相关分析和通径分析，结果表明，瓜长、瓜肉致密性与单瓜质量呈极显著正相关，中腔与单瓜质量呈极显著负相关，横径与单瓜质量呈显著负相关，瓜肉致密性是构成冬瓜单瓜质量的最主要性状。种子千粒质量是种子活力的重要指标之一，刘文睿等[72]利用冬瓜材料B214（小籽粒）和B227（大籽粒）配制六世代群体对种子千粒质量性状进行遗传研究，发现大小籽粒受1 对加性主基因+加性-显性多基因控制，不存在杂种优势。主基因+多基因在B1、B2及F2群体的遗传率分别为68.82%、75.70%和76.29%。

6 存在问题及展望

目前我国冬瓜的育种研究存在的主要问题有：冬瓜和节瓜的种质资源相对较少、 种质资源的收集、鉴定有待加强；基础研究起步晚、研究深度不够，对育种的贡献率低；重要性状的研究不足，遗传规律和基因定位研究不深。因此，今后需要在以下方面加强研究：①深入开展冬瓜和节瓜遗传多样性研究，构建核心种质资源库，为我国冬瓜和节瓜优异种质的挖掘、鉴定和利用提供参考；②加强基因组学研究， 继续开展冬瓜和节瓜全基因组测序、基因组部分测序和简化测序等工作，不断完善冬瓜基因组，对重要功能基因进行快速发掘；③加快分子标记辅助育种，实现分子育种与常规育种技术的紧密结合，提升冬瓜育种水平，创新种质资源和培育新品种；④加强抗性机理研究，开展冬瓜枯萎病、疫病等的研究，建立人工接种、筛选技术体系，开展抗性相关基因组分析。