水稻赖氨酸含量测定方法改进及其最优动态分类研究

陈庭木 李景芳 邢运高 徐波 王宝祥 徐大勇

（江苏省连云港市农业科学院/江苏省现代作物生产协同创新中心，江苏连云港 222006；第一作者：chentingmu@139.com；*通讯作者：xudayong3030@sina.com）

随着生活水平的提高，人们对稻米营养品质的需求也在提高。在稻米储藏蛋白质中，赖氨酸是第一限制氨基酸，提高赖氨酸含量就提高了稻米蛋白质的利用率[1]。高赖氨酸稻米作为肉鸡的饲料，其饲喂效果也较好[2]。不同水稻品种赖氨酸含量存在显著差异[3-4]。筛选高赖氨酸含量的品种，需要有高赖氨酸含量的种质资源。苗桂珍[5]研究了染料结合法（国标法，DBL）在谷类作物赖氨酸含量测定中的应用；谢琳等[6]研究了DBL法在牛乳中赖氨酸含量的测定。由于DBL法对样品和试剂消耗量大，工作效率较低，王红梅等[7]将其改良成等比例、小体积反应体系，结果证实改良后的方法并未降低试验的准确性和精度。陈岩等[8]应用此法测定了玉米的赖氨酸含量，也获得了较精确的结果。冯东等[9]研究了用生物传感器测定赖氨酸含量，测定结果与DBL法间无显著差异，但该方法对仪器依赖性强。DBL法是通过振荡器振荡来促进酰化过程与反应过程，由于目前超声振荡器已经普及，且能显著促进化学反应，加快试验进程，很多试验中将振荡器振荡改为超声振荡。应用超声振荡测定稻米中赖氨酸含量尚未见报道。为此，设计了本试验，以简化水稻赖氨酸含量的测定方法。

1 材料与方法

1.1 适宜酰化用时反应用时组合试验

以自育通过国审中粳糯品种中种香糯和矮秆早熟中籼资源中9黄（蛋白质含量11.0%）为试验材料。本试验将国标方法改进为小样试验，将振荡过程全部改为超声处理，超声功率300 W，超声期间不加温，超声时长达60 min时加1袋400 mL的冰，防止超声器水温过高（超过50℃），探索适宜的超声处理时间组合。

中种香糯酰化超声用时分别为5 min、10 min，反应用时分别为30 min、40 min、50 min、60 min、75 min和90 min，共12种组合。中9黄酰化超声时间分别为10 min、15 min、20 min、30 min，反应期间超声时间分别为75 min、90 min和105 min，共12种组合。国标法为对照（采用振荡器振荡，酰化时间为10 min、反应时间120 min），每个处理3次重复。试剂添加方法参考王红梅等[7]方法。

1.2 不同种质资源赖氨酸含量测定

参考王红梅等[7]方法测定供试46份资源的赖氨酸含量。振荡处理部分修改为酰化超声处理15 min、反应超声处理90 min，反应超声60 min时加入1袋400 mL冰于超声器内以降低温度。这46份参试材料为：3150、C146、H09/sd_m F4 -1 -1、H09/sdmBC1F3 -1 -1、H09/sdmBC1F3 -2 -1、H09/sdmBC1F3 -4 -1、IR29、WH26、Y58S/粤奇丝苗F3-4-1、丰软占、广占63S BC6F4-1-1、广占63S BC6F4-2-1、广占63S BC6F4-3-1、广占63S BC6F4-5-1、广占63S BC6F4-6-1、广占63S BC8F3-2-2、广占63S/sd_m BC1F3-1-1、广占63S/sd_m BC1F3-3-1、广占63S/wxBC1F3-9-4、广占63S/玉香占F3-1-1、广占63S/玉针香F3-1-1、广占63S/玉针香F3-2-1、合美占、黑保、黑脚占、黑珍米、黄合占、黄软占、莉丰占、潘籼10、齐华占、五广占、新黄占、徐R6547、徐引黑籼、扬辐糯4号、玉桂香、玉香油占、玉香占、玉针香、粤晶丝苗/wxBC1F3-1-1、粤晶丝苗/wxBC1F3-2-1、粤农丝苗、粤特13、粤油丝苗、早粳占。

1.3 赖氨酸含量最优动态聚类

采用陈庭木等[10]研究成功的最优化算法，将分类数设为n，则分类间隔有n-1个，针对分类间隔作优化，分类间隔初始值为等间隔设置，之后在分类指标极小值与极大值间随机变异，以分类方差分析的F值最大化为目标，不断择优生成新的亲本群体，再执行杂交变异与突变变异产生新的选种个体，重复择优与变异的过程，直到分类F值收敛到最大值为止，确定最终分类间隔取值，执行分类并对分类方案进行方差分析与t测验法多重比较。本文中将赖氨酸含量分为五类，即低赖氨酸、较低赖氨酸、中等赖氨酸、较高赖氨酸和高赖氨酸。

1.4 统计分析

采用Excel 2010软件对数据进行统计与分析，采用单因素重复观察模型作方差分析。

2 结果与分析

2.1 赖氨酸含量测定方法优化

中种香糯采用处理组合单因素方差分析，模型不显著，且处理内偏差较大，有多个试验样本数据出现负值异常，说明有些试验处理不合理。由图1知，酰化5 min数据出现且试验误差大，酰化10 min数据未出现异常，但反应用时少的处理试验误差仍然很大，反应用时75 min、90 min及对照3种处理独立作方差分析，三者间差异亦不显著，但反应用时90 min测得值要高于对照，误差略大。由于中种香糯试验处理设置不理想，重新设计中9黄的赖氨酸含量测定试验。

中9黄试验方差分析显示，不同处理间差异不显著（表1）。有些处理水平试验误差很大，可能与酰化不充分或反应不充分有关，去除5组误差较大组合，重新方差分析，模型达到显著水准。但最优处理与对照间差异仍不显著。由图2可知，酰化10 min普遍测得值偏低，反应75 min普遍测得值误差偏大。如果酰化15 min、反应90 min，试验测得数据高而误差小。另外，酰化与反应总用时达到105 min的处理误差均较小，可能充分酰化最低用时15 min、反应最低用时90 min，但反应时间也不宜过长，避免因超声器内温度过高增加误差。故将最优超声处理时间组合设为酰化超声15 min、反应超声90 min，反应超声60 min时加入1袋400 mL冰袋于超声器内降低温度，防止温度上升过高。

图1 中种香糯在不同处理下赖氨酸含量测定结果

表1 不同超声时间组合与对照间测得中9黄赖氨酸含量多重比较结果

图2 中9黄不同处理赖氨酸含量测定值及其误差表现

表2 不同资源材料赖氨酸含量

图3 46份水稻资源材料赖氨酸含量分布

2.2 不同资源材料赖氨酸含量分布

从表2可见，46份水稻资源材料赖氨酸含量平均值为0.26%、最小值为0.06%、最大值为0.43%、标准偏差为0.12%、变异系数为46.06%，赖氨酸含量变异范围较大。

2.3 赖氨酸含量分类标准

依据陈庭木等[10]的轮回选择算法，针对所研究46份样本，分为五类，亲本群体大小为100，每代经过变异产生4 000个体，经过三轮进化计算，收敛到最终分类方案，经方差分析，F=454.7469，达极显著差异，多重比较显示，任意两类间均差异极显著。高赖氨酸含量品种有：H09/sdmBC1F3-4-1、广占63S/sd_m BC1F3-1-1、广占63S/sd_m BC1F3-3-1、合美占、黑保、黑脚占、黑珍米、莉丰占、粤农丝苗，占比近20.0%；较高赖氨酸品种数量较多（图3）。由获得资源系谱可知，sdm系列杂交后代赖氨酸含量高，sd_m是中籼品种9311的矮秆突变体矮9311[11]，黑保与黑珍米是黑米品种，合美占、莉丰占、粤农丝苗是广东引进优良外观中籼常规水稻品种。由筛选结果可以推测：一是高赖氨酸品种选育首先要选用高赖氨酸资源；二是黑米品种可能多数是高赖氨酸资源，本次试验仅有2份黑米资源，全归类为高赖氨酸资源，但这一点有待深入试验证实。依据分类参数，可将含量高于0.37%的品种暂定为高赖氨酸品种。如果测定亲本量足够大，如达到1 000份以上，可能会得出更好的结果。

3 讨论与结论

3.1 赖氨酸含量测定方法改进

研究结果表明，赖氨酸含量测定中将振荡器振荡改为超声振荡处理可行，能提高测定结果同时降低误差。本次试验中，在超声300W条件下试验用时达到105 min，如果提高超声功率，理论上能加速反应过程，达到缩短试验过程的目的，需要对不同最大功率的超声仪器进行测定方法优化。

3.2 高赖氨酸含量育种方向

高赖氨酸育种中不可避免提高水稻的蛋白质含量，随着蛋白质含量的提高，水稻的适口性会降低，故高赖氨酸含量育种一般不能针对食用品种，主要用于改良米粉稻或饲用稻。米粉稻提高赖氨酸含量有助于提高配方米粉的营养价值，对部分替代乳制品有良好前景。饲用稻主要是提高蛋白质含量，以提高饲用价值。平均氨基酸总量和必需氨基酸含量都有一定的杂种优势[12]，故饲用稻应采用杂交稻育种为宜，不仅提高饲用价值还能提高产量；大胚米中必需氨基酸与脂肪含量显著高于普通米[13]，米粉稻中为了提高蛋白质含量和脂肪含量，特别适合应用高赖氨酸资源与巨胚基因结合。