双荧光素酶报告基因验证微小RNA410对白细胞介素-13基因的靶向调控作用

金蓉，刘冬云，胡素娟，林荣军

(青岛大学附属医院，山东青岛 266000)

微小RNA(miRNA)是真核生物中一类长度为18～25个核苷酸的内源性非编码RNA，具有高度保守性、时序性和组织特异性，主要通过与靶基因mRNA的3’UTR上的互补区域结合，在转录后水平负性调控靶基因的表达，参与生物的发育、增殖、分化、凋亡过程[1-3]。哮喘是一种遗传易感性的慢性气道炎症性疾病，涉及多种细胞、细胞因子以及与免疫调节密切相关的信号通路[4]。越来越多的研究证据表明，多种miRNA参与哮喘的气道炎症调节[5]。本课题组前期研究发现，鸡卵白蛋白(OVA)诱导的哮喘小鼠体内微小RNA410(miR-410)含量较对照组明显降低，考虑miR-410可能参与哮喘发病过程。本研究拟通过生物信息学方法预测miR-410与IL-13基因的结合位点，并通过双荧光素酶报告系统验证miR-410对IL-13基因的直接靶向关系，为进一步探索miR-410在哮喘发病机制中的作用提供参考。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

双荧光素酶检测系统、psiCHECK-2(promega)；多功能酶标仪(SpectraMax i3x，Molecular Devices)；凝胶成像系统(Tanon-1200，上海天能科技有限公司)；大肠埃希菌菌株DH5α、293T细胞、miR-410模拟物和miRNA无义序列阴性对照、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；IL-13目的基因序列和突变序列(Invitrogen)；限制性内切酶XhoI和NotI、T4 DNA连接酶、DNA ladder(Fermentas)；质粒DNA抽提试剂盒(Qiagen)；KOD高保真酶PCR试剂盒、Taq酶(TOYOBA)。

1.2 方法

1.2.1 生物学信息预测 利用靶基因预测软件targetscan(http://www.targetscan.org)对miR-410靶向结合IL-13 3’UTR的位点进行分析，结合位点见图1。

图1 miR-410靶向结合IL-13 3’UTR的位点

1.2.2 双荧光素酶报告载体的构建和鉴定 分别化学合成IL-13 mRNA结合位点的野生型和突变型序列的正义链和反义链，目的片断插入XhoI、NotI位点。用XhoI、NotI 37 ℃酶切psiCHECK-2载体回收线性化载体片段。目的基因片段与线性化载体连接，将连接产物转化感受态细胞，筛选质粒克隆，提取质粒DNA，分别进行酶切鉴定及测序鉴定。

1.2.3 细胞转染 事先准备好用于转染的分到96孔板中的293T细胞和目的质粒。将10 μL DMEM与0.16 μL的psiCHECK-IL-13-wt/mut目的质粒以及miR-410-3p/Negative Control(NC)充分混匀后室温放置(溶液A)，之后将10 μL DMEM与0.3 μL的转染试剂充分混匀(溶液B)，室温放置5 min。将溶液A与溶液B充分混匀，室温放置20 min。转染前为细胞换取新鲜培养基，之后将转染混合物加入混匀。37 ℃、5%CO2培养。转染6 h后换取新鲜培养基，转染48 h后收集细胞检测。

1.2.4 荧光素酶报告基因验证 以96孔板每孔100 μL的量加入细胞悬液，室温摇床上缓慢摇15 min后，将细胞裂解液吸至1.5 mL离心管，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清液移入新的管子；96孔板中加入Luciferase Assay Reagent Ⅱ(LAR Ⅱ)工作液100 μL，加入20 μL细胞裂解液，移液枪吹打混匀2～3次，测定记录Firefly luciferase(Fl)值(内参值)。加入100 μL Stop & Glo Reagent，移液枪吹打混匀2～3次，测定记录Renilla luciferase(Rl)值，即为报告基因发光值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 荧光素酶报告基因载体酶切分析

psiCHECK-IL-13-wt/mut质粒提取后应用XhoI、NotI双酶切，结果psiCHECK-IL-13-wt/mut在相应片段大小的位置切出来载体条带和目的DNA片段，释放出约500 bp大小的片段。见图2。

图2 psiCHECK-IL-13-wt/mut质粒的酶切鉴定

2.2 荧光素酶报告基因测序分析

将含有miR-410结合位点的野生型和突变型序列的IL-13 mRNA载体进行测序，结果表明野生型和突变型IL-13 mRNA荧光素酶报告载体均构建成功。见图3。

A

2.3 荧光素酶活性测定

将miR-410模拟物与野生型载体psiCHECK-IL-13-wt共转染293T细胞后，细胞荧光素酶活性明显下降，与突变型载体psiCHECK-IL-13-mut比较差异有统计学意义(t=5.697，P<0.01)；与对照组NC结合野生型psiCHECK-IL-13-wt载体比较，荧光素酶活性降低(t=2.852，P<0.05)。见图4。

图4 荧光素酶活性测定

3 讨论

支气管哮喘(简称哮喘)是由包括嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等多种细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[6]。近年来miRNAs在哮喘发生发展中的作用引起众多关注。miRNA是一种由18～25个核苷酸组成的非编码RNA，其功能强大，能够通过与靶基因mRNA的非编码区的结合位点结合并参与基因转录后的调控和基因的降解[7]。越来越多的研究发现miRNA在哮喘发病机制中具有重要作用[8-10]。Williams A E等[11]发现，哮喘患者肺组织中miR-92、miR-26a、miR-200c、miR-16、let-7b、miR-125、let-7及miR-26的含量与正常对照组存在差异。Kumar M等[12]研究证实，let-7在缓解哮喘气道炎症、降低气道高反应性、防止黏膜上皮细胞化生及上皮细胞纤维化方面的作用。本课题组前期研究显示，miR-410在OVA诱导的过敏性哮喘小鼠模型中的表达水平明显低于对照组小鼠，提示miR-410可能参与过敏性哮喘的发病过程[13]。

在过敏性哮喘的发生发展过程中，Th2型细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13对炎症细胞如巨噬细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞的浸润起到重要作用[14-16]。IL-13主要由Th2细胞、肥大细胞、单核巨噬细胞在活化状态下分泌。IL-13诱导B淋巴细胞合成大量的IgE抗体同时增加嗜酸粒细胞的募集，引起气道上皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，诱导黏液产生和杯状细胞增殖，刺激气道平滑肌收缩，提高细胞外胶原蛋白和纤维母细胞向成肌纤维细胞表型转变等[17]。IL-13能够通过IL-13 Rα1与IL-4R形成受体复合物，参与信号转导,激活靶基因转录，诱导Th0细胞分化、气道炎症、气道高反应、黏液产生。IL-13主要通过气道上皮细胞、平滑肌细胞来调节哮喘个体小气道嗜酸粒细胞的募集[18]。抑制Th2型细胞因子，特别是IL-13的促炎作用是哮喘免疫治疗的一个发展方向[19]。目前已经开发出抗IL-4抗体、抗IL-5抗体以及抗IL-13抗体等抑制相关炎症因子的单克隆抗体[20]。相关研究[21-22]发现，抗IL-5抗体及抗IL-13抗体组可明显抑制OVA诱导的哮喘小鼠肺部嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润。但是单克隆抗体制作工艺相对较长，还存在安全、免疫原性等一系列问题[23-24]。因此，从哮喘发生机制靶基因方面，本研究试图探讨某种靶向治疗哮喘Th2因子相关的药物，从而阻断过敏性哮喘的发生和发展。本研究发现，miR-410在体外试验方面能够抑制IL-13 mRNA荧光素酶载体的荧光素活性，证实了miR-410能够靶向调控IL-13 mRNA。

本研究通过生物信息学软件targetscan预测发现了IL-13 3’ UTR存在可能被miR-410结合的潜在靶点，通过构建psiCHECK-2双荧光素酶报告基因载体，从体外试验层面验证了miR-410对IL-13 mRNA的靶向结合作用，提示miR-410能够靶向调控IL-13 mRNA，从而影响其转录及表达。本研究确定了miR-410和IL-13 mRNA的靶向调控关系，为进一步在体内试验层面上研究其在哮喘发病中的作用奠定了基础。