microRNAs影响急性髓系白血病细胞分化的研究进展

王洪涛，陈万灵,2*

（1.厦门医学院临床医学系，福建 厦门 361023；2.厦门医学院附属第二医院，福建 厦门 361021）

microRNAs（miRNAs）是约22个核苷酸的小RNA分子，与靶mRNA的3’-非反式区（3’-UTR）结合，诱导mRNA降解或抑制翻译，并在转录水平上负调控靶基因的表达[1]，参与细胞分化、增殖、凋亡和迁移等一系列生物学过程，miRNAs的异常调节已被证实与诸多疾病的发生发展有关[2]。目前已知的miRNAs 包括：miR223、miR-29、miR-142-3p、miR-9、miR-181a、miR-150、miR-22、miR-34a、miR-342、miR-128a/b、miR-146、miR-10a/b、miR-451、miR-17-92等。

急性白血病（acute leukemia，AL）是一类造血干祖细胞的恶性克隆性疾病，与白血病细胞自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻有关，分为急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）和急性淋巴细胞白血病。已发现多种miRNA与AML细胞分化相关。本文将对影响AML细胞分化的microRNAs进行综述。

1 miRNA家族

1.1 miR-223 MiR-223在X染色体q12上。在髓系细胞生成过程中miR-223 表达稳步增加，抑制miR-223 表达会阻碍粒细胞成熟和白血病的发生[3-4]。在脐带血CD34+细胞中敲除或过表达miR-223的实验结果表明[5]，在体外敲除miR-223延迟了红系祖细胞分化，而在体内过表达miR-223可增加红细胞、T 淋巴细胞、早期B 淋巴细胞的生成。上述研究结果提示miR-223在造血干细胞和祖细胞分化、粒细胞生成过程中具有重要作用。

miR-223表达受多个转录因子的调控。有研究[4-6]表明，转录因子NFI-A和C/EBPα可与miR-223前体启动子竞争性结合而调节miR-223的表达水平。NFI-A使miR-223维持在较低水平，而全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）诱导的C/EBPα 表达则导致miR-223 表达上调，并促进白血病细胞向粒细胞分化。miR-223抑制NFI-A翻译，产生有利于粒细胞分化的负反馈环。另外，白血病中的部分融合蛋白可抑制 miR-223 的表达。Fazi 等[7]研究表明，miR-223 在含AML1/ETO（AE）融合蛋白的AML细胞中表达下调，并确定了miR-223是AE融合蛋白的直接靶点，AE可通过募集染色质重构酶而诱导miR-223沉默。AE蛋白水平的下调能上调miR-223 的表达水平，从而促进白血病细胞分化。另外，过表达miR-223 也可使含PML/RARα 融合蛋白的NB4 细胞向粒细胞分化[6]。miR-223 的异常表达可诱导HL60 细胞向粒细胞分化，但该细胞株并无表达融合蛋白[7]。说明融合蛋白不是miR-223调节造血细胞分化过程中的关键蛋白。

Pulikkan 等[8]发现miR-223 可靶向作用于转录因子E2F1，从而抑制髓系祖细胞增殖，并促进细胞分化。另外，Johnnidis 等[9]在小鼠中敲除 miR-223 基因 ，这些 miR-223 缺陷的小鼠粒细胞增多，并处于高炎症状态。研究还发现，促进髓系祖细胞增殖的转录因子MEF2C 是miR-223 的靶基因。缺失MEF2C 基因可抑制miR-223 缺失的小鼠的祖细胞增殖，并减少中性粒细胞数量。因此，miR-223 可能是祖细胞增殖、粒细胞分化和活化的负调控因子。有研究[6-8]显示，miR-223 是粒细胞分化的正向调节因子，这可能因为在髓系细胞发育的不同阶段，miR-223 表达的浓度不同，导致其功能不同[9]。

1.2 miR-29、miR-142-3p 人类miR-29 家族分布于1 号染色体和7号染色体，主要有3个成员，包括miR-29a、miR-29b和miR-29c。人的miR-142 基因定位17 号染色体上。premiR-142 长度为87 个核苷酸，能编码两种成熟的miRNA（miR-142-3p和miR-142-5p）。Wang等[10]在白血病细胞株和CD34+造血干/祖细胞的分化过程中检测到miR-29a 和miR-142-3p表达上调。通过功能获得和功能丧失的实验，表明在佛波醇酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）或ATRA诱导下，上述两种miRNAs能促进HL-60、THP-1或NB4细胞分化，并可直接抑制cyclin T2（CCNT2）基因，诱导单核细胞分化。此外，miR-29a 靶基因细胞周期蛋白依赖性激酶6（CDK6）、miR142-3p 的靶基因 TGF-β 激活激酶 1/MAP3K7结合蛋白 2（TGF-βactivated kinase 1/MAP3K7 binding protein 2）均参与调节粒细胞和单核细胞分化[10]。

另外 ，在 AML 细胞中 miR-29a 和 miR-142-3p 表达显著降低，靶基因的蛋白表达水平明显升高[10]。在正常人与AML 患者的造血干/祖细胞中过表达miR-29a 或miR-142-3p，他们的靶基因表达下调，同时可促进髓系细胞分化[10]。上述发现证实miR-29a 和miR-142-3p 是正常髓系细胞分化的关键调控因子，低表达参与AML的发生发展过程。

1.3 miR-9 在PMA诱导THP-1细胞的单核细胞分化模型中，Chen 等[11]发现miR-9 的表达在细胞分化过程中显著下调。在t（8；21）的AML 中，过表达miR-9 可抑制人类AML细胞和异种移植小鼠模型的白血病细胞生长，诱导向单核细胞分化，并抑制细胞增殖[12-13]。在体外和体内实验中，miR-9可通过结合let-7 靶向LIN28B/let-7/HMGA2 轴抑制AML t（8；21）阳性细胞株kasumi-1细胞的生长，诱导KASUMI-1细胞分化[12]。另外，加入miR-9-1 也可诱导SKNO-1 细胞分化并抑制其增殖[13]。另一方面，沉默miR-9-1 可促进靶基因（RUNX1、RUNX1T1 和RUNX1-RUNX1T1）的表达，抑制t（8；21）AML 细胞株的分化和增殖[13]。在EVI1 诱导的AML中，沉默miR-9 表达导致细胞凋亡和髓系细胞生成减少[14]。提示miR-9在AML中发挥促进造血细胞分化的作用。

1.4 miR-181 miR-181家族包括4个高度保守的成熟miRNA成员，即miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d。目前较多报道集中在miR-181a，关于miR-181c 和miR-181d 的研究报道较少。在正常骨髓中，miR-181a主要存在于B淋巴细胞、T 淋巴细胞、单核细胞和粒细胞中[15]。Chen 等[16]研究表明，过表达miR-181 能增加体内外B 淋巴系细胞的比例，表明miR-181 是B 淋巴细胞分化的正调控因子。研究还发现当B淋巴细胞增多时，髓系细胞和其他类型淋巴细胞的分化并未完全被阻断，表明miR-181 可能是功能的调节者。Debernardi 等[17]报道 miR-181a 在 AML FAB M1/M2 患者中的表达水平较M4/M5 高，间接说明miR-181a 与髓系细胞分化相关。此外，在红系分化过程中miR-181a 和miR-181b 的表达水平升高[18]。

1.5 miR-24 miR-24在不同分化程度的造血细胞中的表达不同。如miR-24 富集于正常人CD34+造血干/祖细胞中[19]。Lal 等[20]报道miR-24 在造血细胞分化过程中表达上调。Sharbati等[21]研究表明，在单核系分化过程中miR-24表达上调。miR-24可通过多个靶基因参与造血细胞的增殖、分化、凋亡等过程。如Zaidi 等[22]报道上调miR-24 可抑制MAPK磷酸化而激活下游信号通路，从而促进髓系细胞增殖，阻滞粒系细胞分化。miR-24 可与ALK4 的3’-UTR 结合而下调ALK4 的表达，从而抑制红系细胞分化、CD34+造血祖细胞成熟[23]。

1.6 miR-22 在 HL-60、THP1 和CD34+造血干/祖细胞向单核/巨噬细胞分化过程中，Shen等[24]检测到miR-22表达增加，证实单核/巨噬细胞分化过程中关键的转录因子PU.1，在分化过程中促使miR-22 的激活。通过过表达和沉默实验，Shen 等[24]证明 miR-22 促进单核/巨噬细胞分化，MECOM（EVI1）mRNA 是 miR-22 的直接作用的靶基因，MECOM（EVI1）在分化过程中起负调节作用。miR-22介导MECOM降解，提高c-Jun 表达水平，并减少MECOM-和GATA2 介导的干扰作用，最终增加c-Jun 和PU.1 的相互作用，从而促进单核/巨噬细胞的分化。Shen等[24]还观察到在AML患者中，PU.1和miR-22显著下调，MECOM显著上调，miR-22的再导入缓解AML患者的分化障碍，并抑制骨髓原始细胞的生长。提示miR-22 在正常造血和AML 发展中的新功能和作用机制，并体现其在AML诊断和治疗中的潜在价值。

1.7 miR-34a miR-34是一个进化保守的miRNA家族，共3个成员：miR-34a、miR-34b、miR-34c。可检索到 miR-34a 与AML 细胞分化的报道。Navarro 等[25]报道 miR-34a 在 PMA诱导的巨核细胞分化过程中表达上调，而在氯化高铁血红素诱导的红细胞分化过程中表达并未上调。在K562细胞中过表达miR-34a可抑制细胞增殖，导致细胞周期阻滞在G1期，促进巨核细胞分化。miR-34a在血小板生成素诱导的CD34+造血干细胞的分化过程中表达上调，且过表达miR-34a可显著增加巨核细胞的数量。miR-34a 直接调节MYB 的表达，MYB 可促进巨核细胞分化，并可调节CDK4 和CDK6 的表达，以抑制 G（1）/S 转换。然而，miR-34a 靶基因在未加入miR-34a的情况下可诱导巨核细胞分化，并迅速下调。表明miR-34a并不参与最初的下调，但可能在此后的维持抑制作用方面发挥作用。

1.8 miR-342 De 等[26]确定 miR-342 是 ATRA 在诱导 APL分化过程中上调的一种miRNAs。miR-342是造血关键转录因子PU.1、干扰素调节因子（IRF）-1 和IRF-9 的直接转录靶点。IRF-1维持miR-342在低水平；PU.1和IRF-9在ATRA介导的细胞分化的启动子区域结合，从而上调miR-342 的表达。此外，De 等[26]还发现在 APL 细胞中过表达 miR-342 可促进ATRA诱导的细胞分化。表明miR-342是ATRA诱导的APL向粒细胞分化的新参与者。

1.9 miR-150 AML细胞株HL60、PL21和THP-1的高通量基因表达谱研究[27]表明，与正常细胞相比，在表达miR-150的细胞中，CEPBA、CEBPE和与髓系分化相关的细胞因子的激活有助于髓系细胞分化。Morris 等[28]研究显示，miR-150在AML 中低表达，再引入miR-150 表达可诱导髓系细胞分化并抑制AML细胞增殖。表明miR-150可促进髓系细胞分化，而miR-150 的缺失或低表达将导致AML 细胞停滞向髓系细胞分化。

1.10 miR-128 miR-128 包括 miR-128-1 和 miR-128-2，分别定位于人染色体2q21.3和3p22.3上，两者均可生成相同的miR-128。De 等[29]发现与正常人CD34+祖细胞相比，Lin28A在AML 患者白血病细胞和AML 细胞株中低表达。在体外将Lin28A 转染到NPM1 突变的OCI-AML3 细胞株中，Lin28A 可促使细胞周期停滞和髓系细胞分化，并增加EGR2、ZFP36 和 ANXA1 的表达。感染 miR-128 慢病毒的OCI-AML3 可下调Lin28 表达，抑制向巨噬细胞分化。在OCI-AML3 和APL/AML 白血病细胞中沉默miR-128a 可诱导髓系细胞分化，增加 Lin28A、EGR2、ZFP36 和 ANXA1 的表达，逆转髓系细胞分化阻滞。提示miR-128a/Lin28A轴在AML细胞分化受阻中的作用。

1.11 miR-146 人类miR-146 位于5 号染色体上。Yuan等[30]发现对苯二酚诱导CD34+细胞（暴露5d）和HL-60 细胞（暴露3 h）分化为髓系细胞和免疫细胞的数量明显减少，同时 miR-146a 表达上调 ，TRAF6 和 NF-κB 表达下调。使用miR-146a-5p抑制剂抑制miR-146a的表达，可在一定程度上减轻对苯二酚对髓系细胞分化的抑制作用，TRAF6 蛋白和磷酸化IκBα蛋白的水平也恢复到与对照组相同的水平。表明miR146与AML的细胞分化相关。

1.12 miR-10 miR-10a/b 是miR-10 家族的成员，定位于17号染色体。miR-10a/b 在t（8；21）、t（9；11）、NPM1 突变的AML 患者中显著升高，尤其是 M1、M2 和 M3 亚型[31]。患者异常高表达miR-10a/b 导致异常造血祖细胞无限增殖，并抑制造血细胞分化成熟。miR-10a过表达与FAB-M3/t（15；17）亚型、NPM1 突变相关，可促使骨髓中的幼稚细胞百分比降低；而 miR-10b 的过表达与 NPM1、DNMT3A 突变相关，则骨髓中的幼稚细胞百分比升高[32]，且单核细胞分化的调节因子KLF4 与细胞周期的调节因子RB1CC1 是miR10a 的靶基因[33]。

1.13 miR-451 miR451 是近年新发现的miRNA，位于17号染色体q11.2。Bruchova-Votavova 等[34]研究结果表明，miR-451参与红系分化的调节，并具有促进分化的作用。另外，通过功能丧失和获得实验，Song等[35]证明人异质性胞核核糖核蛋白A1（hnRNP A1）在粒细胞分化过程中表达下调，降低对C/EBPα 表达的抑制，增加的C/EBPα 表达可促进细胞分化，miR-451 可通过靶向下调hnRNP A1 而促进粒细胞分化。

1.14 miR-17-92 簇 miR-17-92 簇是报道最多的 miRNA 簇之一。miR-17-92基因簇位于人类基因组染色体13q31.3上，编码 6 个成熟的 miRNAs，包括 miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92a-1。有研究[36]表明，与正常人相比，miR-17-92 在 APL 中表达上调。在 ATRA 诱导 NB4 细胞分化过程中，c-Myc 和miR-17-92 的表达显著受到抑制。在这一过程中，c-Myc直接调控miR-17-92。过表达miR-17-5p 可阻碍ATRA 诱导的细胞分化。另外，miR-17-92 的异常表达抑制DMSO诱导HL-60细胞向粒细胞分化[37]。

1.15 miR-16 miR-16 由22 个核苷酸组成，定位于13q14。Sueur等[38]研究表明，下调miR-16的表达可部分修复经FLT3抑制剂AC220 处理的细胞的增殖作用，而miR-16 过表达则阻止细胞增殖并引起AML细胞向单核细胞分化。MiR-15a/16-1在经ATRA处理的NB4、HL-60和U937细胞株和原代白血病细胞中表达上调。过表达miR-15a/16-1不能直接促使细胞发生分化，但可促进ATRA诱导的NB4和U937细胞分化[39]。

1.16 miR-125 miR-125 家族包括 miR-125a、miR-125b-1、miR-125b-2。miR-125a 定位于 19 号染色体 q13，miR-125a-3p 和 miR-125a-5p 为 miR-125a 的两条成熟的 miRNA。而miR-125b-l 和 miR-125b-2 分别定位于 11 号染色体 q23 上和2l号染色体q21上。Dakir等[37]研究表明过表达miR-125a-5p可促进HL-60/NB4 细胞及CD34+造血干/祖细胞向粒细胞分化。Bousquet 等[40]报道，体外转染miR-125b 可阻止CD34+细胞分化，也可阻断经化学处理的HL60 和NB4 向单核细胞分化。因此，miR-125b 上调可能导致体内白血病细胞分化阻滞。

1.17 miR-126 miR-126 位于人类9 号染色体q34.3。Li等[41]研究表明，过表达miR-126可激活在LSCs/LICs和/或原始HSPCs中高表达的基因，而敲除miR-126则激活在分化较为成熟的造血细胞中高表达的基因。因此，miR-126过表达可能主要作用于原始HSPCs，而miR-126敲除可能主要作用于分化程度较高的祖细胞。

1.18 其他miRNAs 除上述外，还有其他的miRNA 与AML细胞分化相关。如Riccioni等[42]分析miR-21及其靶基因PDCD4（Programmed Cell Death 4，程序性细胞死亡4）在正常造血分化和AML 中的表达。结果表明，在正常的粒细胞/单核细胞分化过程中，miR-21 表达明显上调，与此同时PDCD4 蛋白水平下调。Popovic 等[43]研究表明，在正常骨髓造血祖细胞中过表达miR-196b可促进细胞增殖和提高细胞存活能力，并阻滞部分髓系细胞分化。对CD34+人造血干细胞的获得性和缺失性实验证实，miR-130a 通过干扰关键转录因子的表达抑制单核细胞分化[44]。在体内miR-20a 抑制HIF-1a诱导的U937细胞分化，促进U937细胞增殖[45]。

2 小结

研究发现，越来越多的miRNA 通过影响造血细胞分化而参与AML发生发展过程，有的阻滞造血细胞分化，有的促进造血细胞分化，可作用于不同时期的造血细胞、不同系别的造血细胞。另外，miRNA不仅影响造血细胞分化，也可影响细胞增殖、凋亡等生物学过程，其中影响造血细胞分化的miRNA有望作为治疗AML的新靶点。