地塞米松通过ROS-PI3K/AKT/GSK3β信号通路诱导成骨细胞凋亡

2021-04-02徐先立韩壮张忠文

国际医药卫生导报 2021年5期

徐先立韩壮张忠文

1 沈阳农业大学医院骨科，沈阳 110866；2 中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳110001

骨坏死是一种比较常见的骨科疾病，指由于循环障碍导致的骨细胞和骨髓细胞缺血性死亡［1］。糖皮质激素（GCs）是广泛用于治疗炎症或自身免疫性疾病的药物，包括关节炎、系统性红斑狼疮和严重过敏反应［2］。近年来，大量研究表明过量使用GCs 会抑制成骨细胞增殖并促进其凋亡，从而导致患者发生非创伤性骨坏死［3-4］。长期接受GCs治疗的患者骨折发生率为30%～50%［5］。因此，探讨GCs介导的成骨细胞增殖和凋亡的分子机制至关重要，这可能有助于开发缓解GCs 诱导骨坏死的有效治疗方法。Dex 是一种人工合成的糖皮质激素，可用于治疗红斑狼疮、牛皮癣、过敏性疾病和慢性阻塞性肺疾病等多种疾病［6］。Sato AY等［7］的研究指出活性氧/内质网应激（ROS/ER）与Dex 诱导的成骨细胞和骨细胞凋亡有关。但仍需更多的研究来进一步探索Dex 诱导成骨细胞凋亡的分子机制。在本研究中，我们旨在研究ROS 在Dex 诱导的成骨细胞凋亡中的作用，为进一步了解Dex 诱导成骨细胞凋亡的分子机制提供可能的思路，并为减轻Dex 诱导的成骨细胞损伤和骨坏死提供可能的治疗靶标。

1 材料与方法

1.1 细胞培养人成骨细胞株hFOB 1.19 购自美国ATCC 细胞保藏中心。hFOB 1.19细胞为人胚永生化成骨细胞系，是将SV40 LT 抗原基因转染入自然流产的胎儿组织中使其获得永生化的，与人成骨细胞具有高度同源性，是评价药物影响骨代谢的最佳细胞模型。将细胞培养在Ham"s F12和DMEM 1∶1的混合培养基（含10%胎牛血清）中，常规培养。

1.2 细胞干预及分组细胞经0.25%胰蛋白酶（上海第一生化药业有限公司生产，规格：2.5万U）消化后，调整细胞密度为 5×103个/ml，每孔 200 μl 种植于 96 孔板中，培养24 h 后吸弃培养液，加入0、1、5、25、50、100、200 和300 μM的Dex（美国Sigma-Aldrich 公司），加入培养基至200 μl，每组设4个复孔，于37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h，之后采用MTT法检测细胞增殖率。

为检测ROS 在Dex 影响成骨细胞增殖及凋亡中的作用，我们采用ROS 的清除剂抗坏血酸（AA）和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）处理Dex（广东华南药业集团有限公司生产，规格：075 mg）干预后的成骨细胞，AA 和NAC 均购自美国Sigma-Aldrich 公司。基于此，将 hFOB 1.19 分为 4 组：对照组，Dex 组，Dex+AA 组和 Dex+NAC 组。对照组：不加药物，只培养 48 h；Dex 组：细胞采用 300 μM 的 Dex 处理 48 h。Dex+AA 组：细胞中同时加入 300 μM 的 Dex 及 2 000 μM 的AA，培养 48 h。Dex+NAC 组：细胞中同时加入 300 μM 的Dex及500 μM的NAC，培养48 h。

1.3 细胞增殖率检测将5×103个/ml密度的细胞以每孔 200 μl 种植于 96 孔板中，细胞干预及分组同 1.2 部分，均以只含有培养基的孔为空白孔。处理48 h 后每孔加入10 μl 的CCK-8 溶液，于37℃孵育 1 h，用酶标仪在450 nm 处检测吸光值（OD）。细胞增殖率（%）=（OD试验组-OD空白组）/OD空白组×100%。

1.4 细胞凋亡率检测细胞分组同1.2部分，培养48 h后用 PBS 洗 3 次。然后将 100 μl 的细胞加入至 100 μl 的FITC-Annexin V/PI 检测液中，避光室温孵育30 min。之后采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 ROS 水平检测细胞分组同1.2 部分，培养48 h后用 PBS 洗 3 次，然后用 10 μM 的 DCFH-DA 于 37℃避光孵育30 min，之后采用流式细胞仪检测平均荧光强度。活性氧检测试剂盒购自上海碧云天公司，严格按照试剂盒操作。

1.6 碱性磷酸酶（ALP）活性检测细胞分组同1.2 部分，培养 48 h 后。取 10 μl 的细胞加入 96 孔板中，用碱性磷酸酶检测试剂盒（上海碧云天公司）中的显色底物调整体积至50 μl，摇晃均匀，于37℃孵育10 min。之后每孔加入 100 μl的反应终止液，用酶标仪在405 nm 处检测吸光值。ALP 活性单位的定义为：在pH 9.8 的二乙醇胺（DEA）缓冲液中，37℃条件下，每分钟水解对硝基苯磷酸二钠显色底物产生1 μmol对硝基苯酚所需的ALP 的量定义为一个酶活力单位，也称为一个DEA 酶活力单位。ALP 活性（%）=ALP 活性单位给药组/ALP活性单位对照组×100%。

1.7 Western Blot 细胞分组同1.2 部分，培养48 h 后采用RIPA 裂解液提取各组细胞中的总蛋白，BCA 试剂盒对总蛋白定量。将20 μg的总蛋白加入至上样缓冲液中，采用SDS-PAGE 凝胶电泳分离总蛋白，之后将总蛋白转至PVDF膜上。采用3%胎牛血清封闭45 min后，加入一抗，4℃孵育过夜，TBST 洗 3 次。孵育二抗，室温摇床孵育 1 h，TBST 洗3 次。用电化学发光试剂（ECL）于暗室发光。凝胶成像系统和Image J软件收集处理分析条带，GAPDH为内参。

1.8 统计学分析所有数据采用均数±标准差表示，符合正态分布，数据采用SPSS22.0 软件进行统计学分析。多组建比较采用单因素方差分析，LSD 多重比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Dex对成骨细胞增殖和凋亡的影响如图1所示，与0 μM 的Dex对比，100 μM、200 μM 和300 μM 的Dex可显著抑制成骨细胞的细胞增殖率（均P＜0.05）。而且Dex 的半抑制浓度（IC 50）约在300 μM，因此我们选择300 μM 的Dex应用于后续的试验。如表1所示，与对照组对比，Dex组细胞的细胞增殖率显著降低（P＜0.05），细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）。与 Dex 组对比，Dex+AA 组和 Dex+NAC 组细胞的细胞增殖率显著增加（P＜0.05），细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。

2.2 Dex对成骨细胞中ROS和ALP 水平的影响如表2 所示，与对照组对比，Dex 组细胞的ROS 水平显著增加（P＜0.05），ALP 活性显著降低（P＜0.05）。与 Dex 组对比，Dex+AA组和Dex+NAC组细胞的ROS水平显著降低（均P＜0.05），ALP活性显著增加（均P＜0.05）。

2.3 Dex 对成骨细胞中PI3K 活性的影响如表3 所示，与对照组对比，Dex 组细胞的p-PI3K 相对表达量和p-PI3K/PI3K 比值显著降低（P＜0.05）。与 Dex 组对比，Dex+AA 组和Dex+NAC 组细胞的p-PI3K 相对表达量和p-PI3K/PI3K 比值显著增加（P＜0.05）。各组间PI3K 相对表达量对比差异无统计学意义。