白酒风味物质分析研究进展
2021-04-02牛云蔚李雯慧肖作兵
牛云蔚，李雯慧，肖作兵
(上海应用技术大学 香料香精化妆品学部，上海 201418)
白酒是中国的国酒。我国白酒历史悠久，早在西汉时期便被记录在册。白酒是世界上最受欢迎的6种蒸馏酒之一，与威士忌、白兰地、伏特加、杜松子酒和朗姆酒并列。粮谷经过固态发酵，通过蒸馏、贮存以及勾调孕育出了不同香型白酒。酱香型、浓香型、清香型、米香型是白酒的基本香型，在4种基本香型的基础上衍生出来的香型有芝麻香型、药香型、兼香型、老白干香型、凤香型、豉香型、馥郁香型以及特型[1]。
白酒中的风味物质与人体健康之间存在复杂的关系。高传强研究发现芝麻香型白酒中3-甲硫基乙酸乙酯、3-甲硫基丙醇和3-甲硫基丙酸乙酯等含硫化合物会抑制α-葡萄糖苷酶活性，一定程度上会有降低血糖的作用[2]。白酒中的多元醇可促进胆汁和胰腺分泌，可辅助降血压，还能够通便、预防便秘[3]。杨涛等[4]使用Anin体外模型研究了与白酒相关的健康因素，发现吡嗪类化合物(主要是川芎嗪)与抗氧化活性、增强免疫力有关。一些临床数据显示，适量饮用白酒可以改善循环系统和心血管的功能[5]，还可以减少血栓的形成，预防动脉硬化[6]。白酒产生独特的香气是由于白酒中风味物质的不同配比，但如白酒中醛类含量过高会对人的口腔和食道粘膜有很大刺激，也会增加机体的氧化压力[7]。此外，白酒酿造过程也会产生一些不利于白酒风味的物质，甚至有些物质会对人体健康有损害[8]。
1 白酒中挥发性风味化合物分析研究
白酒中物质的含量、化学性质、极性、沸点、溶解度和挥发度都差异较大，没有固定的前处理方法同时分析所有物质，需要结合不同的前处理方法和分析仪器从而确定香气物质对白酒风味的贡献。白酒挥发性风味物质研究的前处理方法主要有液- 液萃取(liquid liquid extraction,LLE)、搅拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction，SBSE)、分散液- 液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)、固相萃取(solid-phase extraction，SPE)、溶剂辅助风味挥发萃取(solvent assisted flavor evaporation，SAFE)、顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction，HS-SPME)和超临界二氧化碳萃取等。
白酒挥发性风味化合物使用的分析仪器主要有气相色谱- 氢火焰离子化检测器(gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID)、气相色谱- 火焰光度检测器(gas chromatography-flame photometric detector，GC-FPD)、气相色谱- 氮磷检测器(gas chromatography-nitrogen phosphorous detection，GC-NPD)、气相色谱- 质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、二维气相色谱- 质谱(two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry,GC/GC-MS)、多维气相色谱- 质谱(multi-dimensional gas chromatography-mass spectrometry，MDGC-MS)等。白酒的挥发性风味化合物具有成分复杂、含量低的特性，应选择合适的分析技术进行组合。例如，HS-SPME联用GC-MS用于挥发性风味化合物的分析，DLLME联用液相色谱- 质谱用于难挥发性风味化合物和大分子物质的分析。
近年来，人们使用了许多方法和仪器来鉴定挥发性风味化合物。白酒中挥发性风味化合物的定性方法主要有：标准品比较法、保留指数(retention index，RI)、GC-MS、气相色谱- 嗅闻法(gas chromatography-olfactometry,GC-O)等。应用上述前处理方法，分析仪器和定性方法，可以在白酒中鉴定出多种微量、不稳定、低阈值的化合物，如含硫、含氮化合物等。然而，单一的方法是有局限性的，应多种分析方法相结合增加分析结果的准确性。
白酒的定量方法主要有归一化定量法、峰高百分比法、峰面积百分比法、外标法(external standard method,ESTD)、内标法(internal standard method,ISTD)和稳定同位素稀释法(stable isotope dilution analysis,SIDA)。ESTD是通过稀释样品中的每个组分所对应的标准物质，得到不同的浓度梯度，在同样的色谱条件下进样，一系列标准物质的标准曲线由此产生，这样就可以求出样品中各组分的实际含量，校正检测器对不同化合物的响应，在不受其他化合物影响的情况下，结果准确，该方法对前处理、进样量和仪器状态有较高的要求。ISTD是要避免因外界因素产生的误差，所以在样品中加入标准物质，但是标准物质的加入也会引起测量的峰面积不准确，SIDA虽然精密度和准确度都很高，可是同位素内标物不容易获得，大部分要人工合成，但SIDA可能是长期的定量发展方向。
已报道的白酒挥发性化合物有1 870多种，包括酯、内酯、醇、缩醛、酮、酸、芳香族、杂环、醛、含氮化合物、萜类和含硫化合物[9]。Fan等[10]采用HS-SPME和GC-O相结合的方法对洋河大曲的新鲜白酒和陈年白酒的挥发性香气物质进行了研究，GC-MS和GC-O对香气物质定性，且均为双柱定性。研究结果显示：丁酸乙酯，己酸乙酯以及丙酸乙酯在洋河大曲中有很高的风味稀释因子，且酯类化合物是其主要风味成分。聂庆庆等[11]通过LLE结合GC-O、GC-MS对绵柔型白酒中的香气成分鉴定，结果表明：己酸乙酯是最重要的香气成分，其次是己酸、三甲基吡嗪、丁酸乙酯和γ-壬内酯。Niu等[12]用GC-O和GC-FPD方法对清香型白酒的香气成分进行了分析，共检测出80种挥发性风味化合物，其中含硫化合物10种。
2 白酒中非挥发性风味化合物分析研究
白酒中的酿造微生物作为白酒酿造过程中的发酵源，能产生多种风味化合物，如有机酸、酯类、醇类、内酯类、酚类、杂环类、萜类、芳香类化合物、氨基酸和小肽等，白酒中非挥发性风味化合物通常对白酒味觉、口感、健康功能都有影响。
由于白酒中的非挥发性组分的含量较少，在进行样品前处理时通常使用衍生化方法。如果挥发性物质的干扰比较大，待测样品浓度太低，一般会先进行真空旋转蒸发，把挥发性物质去除，或者使用吸附剂吸附、真空冻干、直接真空冻干、温和氮气吹干[13-15]等方法去除香气成分的干扰[16]。通常使用离子色谱法[17-18]、高效液相色谱法、超高效液相色谱法和核磁共振法[19]等对非挥发性组分进行检测。但是对于含量较低的非挥发性组分，需要用衍生化- 气相色谱法[20-22],衍生剂分为烷基化试剂、酰基化试剂、硅烷化试剂、其他衍生试剂。最常用的衍生剂是三甲基硅烷(trimethylsilyl，TMS)[23]、N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺[N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA][24]、N-甲基-N-叔丁基二甲基硅三氟乙酰胺(N-methyl-N-tert-butyldimethylsilyltrifluoracetamide,MTBSTFA)[25-26]、六甲基二硅氮烷(hexamethyldisilazane，HMDS)[27]、三甲基氯硅烷(trimethylchlorosilane，TMCS)。白酒大曲中MTBSTFA作为衍生剂可以检测到9种不挥发性有机酸，21种氨基酸，2种多元醇以及6种其他类化合物[25]。在8种香型白酒(清香型、浓香型、酱香型、芝麻香型、凤香型、豉香型、特型和老白干香型)中BSTFA作为衍生剂检测到48种不挥发物质，其中包括 28 种不挥发有机酸、4 种氨基酸、15 种多羟基化合物和 1 种其他类不挥发物质[28]。在适当的反应条件下，衍生剂可以取代分子中如羧基、羟基、氨基、巯基等活性氢，对含有极性基团的分子，衍生化后的分子挥发性和稳定性均有很大提高。
白酒中已检测到游离氨基酸18种，包括组氨酸、谷氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、精氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丙氨酸、络氨酸、缬氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸[29]。而氨基酸的呈味特征非常复杂，有些呈甜味，有些呈鲜味，酸味，苦味等[30]。白酒含有的小肽包括环状二肽、二肽、三肽和四肽,白酒中发现的具有不同生理和药理活性的小肽使其不同于世界上其他蒸馏酒[31-35]。常见的非挥发性不饱和脂肪酸主要包括油酸，十六碳烯酸和亚麻酸等，非挥发性有机酸主要包括：二元脂肪酸、羰基脂肪酸、羟基脂肪酸、C12以上的直链脂肪酸等[36]。白酒中的非挥发性醇主要包括高级醇和多元醇，有研究通过离子色谱法对白酒中的多元醇进行了测定，且建立了甘油、葡萄糖和鼠李糖等多元醇的定量分析方法[37]。白酒中的非挥发性酯类主要是棕榈酸乙酯、内酯、苯乙酸异丁酯、肉豆蔻酸乙酯、硬脂酸乙酯和苯乙酸乙酯等芳香族酯。Zhou等[38]建立了一种重现性好、抗干扰能力强、快速的GC-MS测定白酒中棕榈酸乙酯的方法。然而，由于白酒中非挥发性酯类化合物的含量低、沸点高，大多数非挥发性酯类化合物在气相色谱中的响应值很低。白酒中芳香酯的HPLC-QQQ分析方法可以同时检测白酒中各种芳香酯的含量，为白酒中芳香物质的检测提供了一种很好的方法[39]。傅玉书等[14]利用TMS衍生结合GC-MS的方法分析了茅台酒中的非挥发性酚类化合物，从中测出了11种非挥发性酚类化合物，分别是对香草酸、羟基苯甲醛、间羟基苯乙酮、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸、邻羟基苯丙酸、水杨酸、香草醛、4-羟基-3-甲氧基苯丙酸、邻羟基苯乙酸、对羟基苯丙酸。
3 风味化合物的相互作用研究
目前关于白酒中香气成分之间相互作用的研究方法主要有S型曲线法、OAV法、σ-τ图法、分配系数法、矢量模型法以及PDE模型法等。
3.1 S型曲线法
研究发现香气化合物或香气化合物的混合物的对数浓度与检测概率存在一定的关系[40-44]，心理测量的浓度反应函数是符合S型曲线的，函数公式见式(1)。
(1)
式(1)中，C代表了待测样品的嗅觉阈值[用log(μg/L)表示]；x代表了待测样品试验浓度[用log(μg/L)表示]；D代表了每种待测样品的参数特征，它决定了函数的斜率；P代表了嗅觉的检测概率，应该使用校正因子P=(3×p-1)/2来校正实际的检测概率(p为每个浓度的实际检测概率)。
当P=0.5时，则为待测样品的检测阈值浓度。使用Feller加合模型[45]来求出混合物的理论检测概率，Feller加合公式见式(2)。
P(AB)=P(A)+P(B)-P(A)P(B) 。
(2)
式(2)中，P(AB)是混合物的理论嗅觉检测概率，P(A)和P(B)分别是待测组分A、B的嗅觉检测概率。香气物质间的相互作用要用理论阈值与实验阈值的比值判定，记R为该比值，当R≤0.5时，协同作用效果；0.5
3.2 OAV法
用X表示混合物的理论OAV以及实测OAV之间的比值，从而来判断组分之间的相互作用效果[49-50]。混合物中各个组分的OAV之和则为理论OAV；而实测OAV是通过混合物浓度和实验阈值的比值来求出。X的计算公式见式(3)。
(3)
式(3)中，OAVmix是混合物的实测OAV，∑OAVi是混合物的理论OAV，Ti和Ci为混合物中第i个组分的阈值和浓度，Tmix为混合物的阈值。当X≤0.5时，表现为协同作用效果；X>1时，表现为掩盖作用效果；X=1时，表现为无作用效果；0.5 σ-τ图法是Patte和Laffort提出的σ=F(τ)模型[54]。通过对A、B化合物单独存在时的香气强度与它们混合物的香气强度进行比较，来判断A、B之间香气强度的关系和影响。σ表示混合物的香气强度及A、B单独存在时香气强度的和的比值，函数公式见式(4)。 (4) 式(4)中，IAB是混合物的香气强度，IA和IB则分别是组分A,B的香气强度。单个组分的香气强度与各组分单独存在时香气强度的和的比值用τ表示，函数公式见式(5)。 (5) 当σ<1时，表现为低加成作用效果。低加成作用效果又有以下3种情况：1)当IAB 分配系数法是由Ettre等[57]用来解释香气物质的释放以及保留现象，这种方法基于物理化学的性质，利用动力学，热力学等手段来研究白酒香气组分的气液平衡，函数方程见式(6)。 (6) (7) 矢量模型法可以直接研究香气物质间的相互作用，便于寻找香气物质之间的作用规律。矢量模型认为混合物香气强度等于混合前各组分香气强度的矢量和[59]，函数公式见式(8)。 (8) 式(8)中，IAB是混合物的香气强度；IA和IB代表了组分的香气强度；α是与组分A、B感知相互作用相关的常数。当IA和IB相等时，矢量模型可简化为式(9)。 (9) 此时混合物的香气强度与组分的香气强度之和存在线性关系，选一些等香气强度的点测定混合物的香气强度，可以根据拟合的线性斜率得出α。混合物的理论香气强度等于未混合组分表示组分的香气强度之和，根据式(8)可求出混合物的实际香气强度，若混合物理论香气强度大于实际香气强度，则为掩盖作用，混合物理论香气强度小于实际香气强度，则为协同作用。刘影[60]将乙酸乙酯、己酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、苯乙酸乙酯和3-甲基丁酸乙酯两两混合，利用矢量模型研究表明，混合物的香气强度与单个组分的香气强度之和存在良好的线性关系。 偏微分方程(partial differential equation，PDE)模型不仅可以分析香气之间的相互作用关系，还可以预测强度，函数公式见式(10)至式(13)[61-62]。 OIm=OI/(lnOAVa+lnOAVb) 。 (10) Xa=lnOAVa/(lnOAVa+lnOAVb) 。 (11) OIa,m=f(1)=(1-x′)·f′(x′)+y′ 。 (12) OIb,m=f(0)=-x′·f′(x′)+y′ 。 (13) 上述公式中a和b是不同的香气化合物，OI代表混合物的总香气强度，OIm代表每lnOAV单位物质的平均香气强度，Xa是组分a的比例。以OIm为纵坐标轴，Xa为横坐标轴，建立拟合曲线，在该曲线(x,y)某点处做切线，切线在纵坐标轴上得到两个截距，就可以得到OIa ,m和OIb,m。OIa,m(或OIb,m)表示每个lnOAV单元物质a(或物质b)的香气强度实际上对整个香气混合物的贡献。刘影[60]用PDE模型和σ-τ图法研究了分子结构相似的醇类化合物(己醇和丁醇)和醛类化合物(2-甲基丁醛和3-甲基丁醛)之间的相互作用，结果表明PDE模型中香气化合物对混合物香气强度的影响和香气化合物在混合物中的比例成正比，且PDE模型对混合物中的香气强度有很好的预测性能。 就食品风味感知而言，白酒独特香气特征的物质基础在于挥发性风味化合物，然而有些非挥发性风味化合物会影响挥发性风味化合物的释放，甚至通过与挥发性风味化合物相互作用影响着白酒的整体香气特征。Zhang等[63]报道了剑南春白酒中一种非挥发性环八肽，在液体样品中添加该环八肽会对顶空浓度产生显著抑制作用，影响最大的是该环八肽和酚类化合物(苯酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、愈创木酚和4-乙基愈创木酚)之间的相互作用，而酯类、醇类、醛类和挥发性酸类的影响不大。热力学分析表明该环八肽与酚类化合物之间的主要作用力是氢键。Huang等[64]研究了中国芝麻香型白酒分离得到的多肽与香气物质的结合能力，多肽能够选择性的影响白酒中挥发性小分子化合物的挥发性能，酯类、醇类和酚类化合物的挥发性影响较大，通过HS-SPME-GC-MS、紫外吸收光谱和核磁共振波谱分析表明：多肽AKRA与对甲苯酚发生了氢键作用，减少了对甲苯酚的挥发性，从而降低了由此带来的异嗅味,且进一步确认了AKRA 与对甲苯酚的结合位点位于 AKRA 结构中的羰基氧与对甲苯酚酚羟基氢之间。 对白酒中挥发性风味化合物和非挥发性风味化合物的分析方法，以及白酒中风味化合物相互作用的研究现状进行了探讨。白酒中的挥发性风味化合物之间会产生加成作用、协同作用、掩盖作用或无相互作用，分析这些相互作用的方法有很多，主要有S型曲线法、OAV法、σ-τ图法、分配系数法、矢量模型法以及PDE模型法。有研究通过S型曲线法表明烷基硫醚对酱香型白酒的水果香味有协同作用等；通过OAV法对茅台酒的研究表明：己酸乙酯与乳酸乙酯，乙酸乙酯这两组混合物分发生了协同作用等，而乙酸乙酯和乳酸乙酯的混合物发生了加成作用等；用σ-τ图法分析了清香型白酒中醛酮类物质和醇类间相互作用，醇类物质基本发生掩盖作用，而己醇和苯甲醇则不发生相互作用，醛酮类物质发生协同作用等；通过分配系数法发现白酒中高浓度的2-苯乙醇和1-丙醇可以抑制3-甲基丁酸的释放，并且1-丙醇对3-甲基丁酸的影响要大于2-苯乙醇等；利用矢量模型法研究发现：混合物的香气强度与单个组分的香气强度之和存在良好的线性关系等；PDE模型法对白酒中混合物的香气强度有很好的预测性能。每种方法都有自己的优缺点，相互验证会使研究结果更准确。 白酒中非挥发性风味化合物可以和挥发性风味化合物发生相互作用，改变挥发性风味化合物的分配系数，从而引起白酒香气的变化，影响白酒的味道和口感属性。未来，除应继续深入探讨白酒挥发性风味化合物之间的相互作用关系，还应从白酒挥发性风味化合物与非挥发性风味化合物相互作用、非挥发性风味化合物之间的相互作用及它们对白酒味道和口感属性的影响方面继续开展研究。3.3 σ-τ图法
3.4 分配系数法
3.5 矢量模型法
3.6 PDE模型法
4 结论与展望
