外周血自噬相关炎症因子表达水平与代谢综合征的相关性

代静澜 李朵 牟海刚 华蕾

(中国人民解放军陆军第958医院心血管内科，重庆 400020)

代谢综合征(metabolic syndrome，MS)是糖类和脂质等多种代谢成分异常聚集而出现的比较复杂的代谢紊乱症候群，已逐渐成为威胁人类健康与生活质量的重要慢性非传染性疾病[1-3]。MS的具体发病机制目前尚不完全明确，不少研究者认为机体的营养过剩和缺氧等造成细胞内内质网应激反应等参与了MS的发病机制，而自噬作为一种细胞对多种应激反应的适应性反应，是内质网应激等应激反应的重要环节，与MS的发病具有一定的联系[4-5]。已有研究[6]表明，在出现胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)时，机体能通过增加自噬以防止胰岛P细胞受伤害，自噬在MS发生和发展中的作用越来越受到医学研究者们的重视，自噬的调控可能是治疗MS的新的切入点，这也是临床医师研究的重点。外周血自噬相关炎症因子微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)和p62是自噬标志性蛋白，其表达水平可反映机体自噬功能的强弱，自噬相关炎症因子Atg5是自噬活动启动的重要调节基因，已被研究证实其与MS的发生与发展具有明显的相关性[7]。目前国内关于MS与自噬相关炎症因子表达水平之间关系的研究报道较少，因此，本研究尝试探讨自噬相关炎症因子表达水平与MS之间的相关性，以期为临床诊断提供一些理论参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2018年7月—2019年6月于中国人民解放军陆军第958医院收治的MS患者96例作为研究组，其中男性53例，女性43例，年龄32～78岁，平均年龄(59.23±8.77)岁。纳入标准：(1)患者符合2005年国际糖尿病联盟颁布的有关MS的诊断标准[8]；(2)年龄>18岁，且病历资料完整者。排除标准：(1)精神异常和沟通障碍患者；(2)存在严重肝肾疾病、恶性肿瘤、严重感染性疾病和出血性疾病患者；(3)近1周有手术治疗患者；(4)有药物滥用史和从事有毒有害作业者；(5)妊娠及哺乳期妇女。采用1∶1配对病例对照研究方法，按照性别和年龄相差≤3岁匹配，收集同期在本院进行健康体检的人群96例作为对照组，纳入性别、年龄与研究组相等的健康体检人群入组，排除与研究组患者存在血缘关系者，患有MS、糖尿病、高脂血症、高血压、心脑血管疾病或其他严重器质性疾病者，妊娠及哺乳期妇女。对照组中男性49例，女性47例，年龄30～79岁，平均年龄(60.15±9.03)岁，两组性别和年龄等比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。患者此次研究在医学伦理委员会审批通过的情况下开始实施，研究内容设计符合《世界赫尔辛基宣言》，患者均知情同意参与本研究。

1.2 方法

1.2.1 体格检查和IR程度评估

现场测量患者的体重、身高、腰围、臀围、收缩压和舒张压等人体参数，采用身高体重仪及台式水银柱血压计进行测量，计算体重指数(BMI)=体重(kg)/身高2(m2)，并采用稳态模型评估法对患者的IR程度进行评估。

1.2.2 血液一般生化指标检测

现场采集两组入选者清晨空腹静脉血，经离心和分离后将血清置于微量离心管放置在-80 ℃环境中冷冻保存。血糖测定采用葡萄糖氧化酶法，采用美国强生公司快速血糖仪(ONE TOUCH SureStep)测定患者空腹血糖(FPG)；采用奥林巴斯AU400全型自动生化分析仪对患者甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平进行测定。采用ELISA试剂盒利用双抗夹心法检测血清炎性因子白介素-1β(IL-1β)水平，试剂盒均由上海恒远生物技术发展有限公司提供。

1.2.3 细胞自噬相关炎症因子检测方法

收集患者清晨空腹肘静脉血，采用蛋白质印迹法测定自噬相关炎症因子LC3、p62和Atg5蛋白表达水平，基本操作方法为：采用人全血蛋白提取试剂盒提取外周静脉血总蛋白质，BCA法测定蛋白浓度，并以10 g/L Buffer缓冲液溶解。以10 μg为上样量进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，40 V预电泳30 min；随后调整为电压90 V电泳60 min。电泳完毕后，经丽春红染液染色观察条带分离状态，转移凝胶上条带通道笔直和分离清晰的蛋白条带至硝化纤维素膜上。5%的脱脂牛奶溶液封闭90 min，加入一抗，4 ℃孵育过夜；含吐温-20的磷酸盐(PBST)缓冲液清洗，加入二抗，28 ℃孵育90 min。抗体均由Abcam公司提供，Atg5、p62和β-actin为单条带，LC3为双条带，分别为LC3-Ⅱ(相对分子质量为17 000)和LC3-Ⅰ(相对分子质量为19 000)。LC3最终表达量以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的结果进行统计。二抗孵育完毕后，PBST缓冲液清洗，进行显影和测量。所得蛋白印迹图片采用Image J图像分析软件扫描，分析灰度值，各观察指标的相对表达量为观察指标的灰度值与β-actin的灰度值之比。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 两组患者一般情况比较

比较研究组和对照组的体格检查和血液生化指标结果发现，两组在身高方面的差异无统计学意义(P>0.05)，但研究组患者的体重、BMI、收缩压、舒张压、腰围、臀围、腰臀比、FPG、TC、TG、LDL-C、IR以及IL-1β均高于对照组(P<0.05)，HDL-C水平低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组患者体格检查和血液生化指标比较

2.2 两组患者自噬相关炎症因子表达水平比较

两组自噬相关炎症因子测定结果显示，研究组Atg5和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达水平明显高于对照组(P<0.05)，p62表达水平明显低于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 两组患者自噬相关炎症因子Atg5、LC3和p62的表达水平

2.3 自噬相关炎症因子LC3、p62和Atg5表达水平与MS患者临床指标的相关性

相关性分析结果显示，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Atg5的表达分别与BMI、收缩压、舒张压、FPG、TC、TG、LDL-C、IR和IL-1β均呈正相关性(P<0.05)，与HDL-C呈负相关性(P<0.05)；而自噬相关炎症因子p62与BMI、收缩压、舒张压、FPG、TC、TG、LDL-C、IR和IL-1β均呈负相关性(P<0.05)，与HDL-C呈正相关性(P<0.05)，见表3和图1。

图1 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Atg5分别与IR和IL-1β的相关性

表3 LC3、p62和Atg5表达水平与MS患者临床指标的相关性

2.4 MS患者自噬相关炎症因子的多元线性回归分析

进一步分别以自噬相关炎症因子LC3、p62和Atg5的表达水平为因变量，年龄、性别、身高、体重、BMI、收缩压、舒张压、腰围、臀围、腰臀比、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、IR和IL-1β为自变量，行多元逐步回归分析结果显示，LC3表达量的重要相关因素为IR、TG和IL-1β；p62和Atg5表达量的重要相关因素均为IR和IL-1β，见表4。

表4 多元逐步回归分析MS患者外周自噬相关炎症因子表达水平的相关因素

3 讨论

自噬是细胞对多种应激反应的适应性反应，是一种细胞应激下的自我保护和防御机制，其在维持机体正常的心血管功能中具有重要作用[9]。大量研究[10-11]表明自噬与MS之间存在密切关系，并参与各种心血管损害的发生和发展。本研究通过对两组自噬相关炎症因子LC3、p62和Atg5的检测，结果显示，研究组Atg5和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达水平明显高于对照组，p62表达水平明显低于对照组，结果表明MS患者外周血存在自噬相关炎症因子LC3、p62和Atg5的异常表达。LC3是自噬的标志性蛋白，存在LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种亚型，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ可反映LC3的活性状态，且是研究自噬的较好标志物[12-13]。p62是一种在多种信号转导途径中发挥作用的支架蛋白，在LC3介导下，可与LC3结合形成自噬小体，最后自噬小体与溶酶体相互融合完成蛋白的降解。当出现细胞自噬反应时，p62聚集体降解增加，导致p62的蛋白水平明显降低[14-15]。Atg5是细胞自噬通路上的关键因子，参与Atg12-Atg5泛素样蛋白结合系统的组成，Atg5蛋白在自噬体的形成过程中具有重要作用。机体Atg5蛋白表达量的增加即意味着细胞自噬过程的抑制。基础研究[16]表明，用3-甲基腺嘌呤抑制自噬或低表达Atg5，无论是否提供外源性脂质油酸盐，肝细胞三酰甘油和脂滴含量均比对照组更高。同时，在用干扰核糖核酸干扰Atg5的肝细胞中，三酰甘油分解减少和脂肪酸的β氧化明显降低。可见细胞自噬具有调控肝脏细胞脂质代谢的功能，参与了脂质的储存调节和分解代谢。且自噬可通过调节内质网应激以调控胰岛素信号通路，减缓IR。Cui等[17]通过高脂高糖饲养SD大鼠制备MS动物模型，发现与对照组相比，MS大鼠肠系膜动脉内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78和C/EBP同源蛋白均升高，与此同时，自噬相关炎症因子Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62均升高。当MS患者机体处于高血糖、脂质代谢异常、高血压和IR状态时，细胞自噬启动代谢调节机制，产生自噬反应清除毒性代谢物和蛋白聚集体等，此时患者细胞自噬活性较强，其相关蛋白LC3和Atg5表达量较高，p62表达量降低。这与有学者[18]在研究报告中指出，在遗传性和高脂饮食所致的肥胖鼠中，脂肪组织自噬相关蛋白LC3、Atg5、Atg6和Atg7水平均表现为明显上升的结果比较一致。

本研究相关性分析结果显示，自噬相关炎症因子LC3、p62和Atg5与MS患者的收缩压、BMI和IR等多项指标有明显相关性。MS的血脂异常包括：TG升高、HDL-C低下、LDL-C正常或轻度升高，以及LDL-C亚型中的小而密LDL-C比例升高，加上IR的存在，可促使三酰甘油分解产生较多游离脂肪酸，游离脂肪酸的增多反过来可使肝脏合成三酰甘油的作用加强，进一步加剧高三酰甘油血症，形成恶性循环[19]。MS患者机体自噬反应能通过抵御脂质过氧化应激和炎性应激等不利条件，及时清除异物，促进脂质的分解代谢，发挥调节脂质代谢、IR、心肌细胞内环境稳定和氧化应激的作用[20]。进一步的多元逐步回归分析结果显示，LC3表达量的重要相关因素为IR、TG和IL-1β；p62和Atg5表达量的重要相关因素均为IR和IL-1β。研究表明，细胞自噬引起的细胞死亡还能导致诸多促炎因子释放，促进炎性反应。MS的发病是一个慢性炎症和进展性的过程，本研究中MS患者的IL-1β水平是LC3、p62和Atg5三个因子的重要相关因素，自噬相关炎症因子LC3、p62和Atg5表达水平与MS患者IR、TG和IL-1β的明显相关性，可看出细胞自噬相关炎症因子不仅与IL-1β和IR等指标关系密切，还可能成为MS发生和发展过程中的重要标志物，对MS患者外周血自噬相关炎症因子表达量的调控有可能成为治疗MS的新靶点，对自噬相关炎症因子p62、LC3和Atg5蛋白在人外周血表达水平的研究也为在临床研究自噬开辟了一个新的通路。

综上所述，MS患者自噬相关炎症因子LC3、p62和Atg5蛋白均呈现高表达，并与患者一般临床指标存在明显相关性，对于研究MS的发病机制和评估患者病情具有一定的指导价值。