消痔灵注射液介导TGF-β1/Smad信号治疗放射性直肠炎出血的分子机制研究

何裕智，李俊

放射治疗过程中，不可避免地会对周围组织造成损伤，导致急性或慢性放射性损伤，当直肠黏膜受损时便会引发放射性直肠炎(radiation proctitis，RP)，是临床放射治疗主要并发症[1]。该病主要见于妇科恶性肿瘤或男性前列腺恶性肿瘤放射治疗，流行病学调查发现，该病五年发病率为12.3%，其中有1.1%的患者确诊为严重直肠炎[1]。便血、腹泻及肠梗阻是该病主要临床表现，病程较长，严重时可出现直肠阴道瘘或膀胱瘘，严重影响患者生存质量。研究发现[2]，放射性损伤与放射性途径相关基因有关，其中转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGFβ1)基因是研究较多的与放射损伤相关的有关基因之一。TGF-β1/Smad信号通路在电离辐射导致的炎症反应中发挥重要作用[3]。因此，可设想通过阻断TGF-β1/Smad信号通路来达到治疗RP的目的。消痔灵注射液是一种中西药相结合的注射用液体，能使小动脉内血栓形成加快，具有收敛、抑菌、止血等作用[4]。本文将采用消痔灵注射液治疗放射性直肠损伤，探究该药通过TGF-β1/Smad信号通路发挥作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料来源

雄性SD大鼠40只，SPF级，6周龄，体质量200～220 g，购于成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCKX川2020-030。将大鼠放在室温15～25 ℃，湿度35%～60%，添加常规饮水及饲料，12 h光照，12 h黑暗，循环进行。

主要试剂及仪器：TGF-β1、Smad 2/3 抗体(Abcam，批号：ab64175、ab63399)；逆转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit)(Fermentas，批号：00130608)；高纯总RNA快速提取试剂盒(Gener-ay，批号：1305G0)；GAPDH Antibody(Bioworld，批号：321205)；HE 染色试剂盒(北京索莱宝，批号：G1120)；中性树胶(北京索莱宝，批号：G8590)；北京天普UV-1600紫外分光光度计；显微镜(日本尼康，Eclipse 80i)；转移脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造公司，型号TS-8)；垂直电泳槽(北京六一仪器厂，型号DYCZ-20C)；直线加速器用瓦里安(Varian)6EX直线加速器(美国)；台式冷冻高速离心机(德国 Eppendorf，Centrifuge 5430R)；台式低速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司，TDZ5-WS)。

1.2 分组及动物模型制作

将40只大鼠分为空白对照组、模型组、消痔灵组、TGF-β1组、TGF-β1联合消痔灵组，各8只。对照组不做任何处理，采用蛋白质含量20%的标准饲料喂养，其他四组均予以固定照射，制作RP模型(图1)。模型制作方法：大鼠肌肉完全松弛后，将大鼠安静地以仰卧体位固定在特制的固定木板上，采用6 MV X射线单次25 GY照射，照射范围自耻骨联合至肛门，照射野面积3 cm×4 cm，放射剂量为20 Gy，剂量率500 cGy/min，仔细观察大鼠接受照射时的情况。消痔灵组在照射后第12周采用消痔灵注射液(吉林省集安益盛药业股份有限公司，产品批号 Z22026175)，每晚一次，2 mL/次，间隔一天灌肠1次共7次14 d。TGF-β1组在照射后第4周开始腹腔注射10 mg TGF-β1抑制剂SB-431542，共注射10 d。TGF-β1联合消痔灵组，照射后第4周开始腹腔注射10 mg SB-431542，共注射10 d；第12周开始给予药物灌肠，方法同消痔灵组灌肠方法。

模型鉴定：每天记录5组大鼠一般状况，包括大鼠的体质量、反应状态活动情况、饮水进食量、大便情况等项目。除空白组外，其他四组大鼠在照射后出现如精神疲惫、反应迟钝、活动减少、饮食饮水减少等情况；大鼠大便带血，经八联试纸检测，结果为潜血阳性[5]。

1.3 指标检测方法

干预结束后2周，所有大鼠采集腹主动脉血标本5 mL，用于炎性因子[白细胞介素2(Interleukin-2，IL-2)、白细胞介素6(Interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)]水平检测；处死，自距肛门2 cm以上获取直肠组织约2 cm，平均分成两部分，一部分放在10%的甲醛固定液中，用于HE染色；另一部分-80 ℃冻存，用于检测TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达情况。

图1 大鼠造模过程及成模后图片 A图：造模中；B图：造模前固定；C图：中度出血；D图：轻度出血；E图：重度出血(伴肛门功能异常)

1.3.1 采用HE染色观察直肠组织病理改变

制备病理切片：取以上冻存组织，水洗后酒精梯度脱水，切去适当形状，采用石蜡包埋；使用轮转机连续切片，切片厚度为5 μm；切片置于42 ℃烤片机，烤片结束后进行HE染色。

HE染色：切片二甲苯脱腊，乙醇梯度冲洗，再用双蒸水冲洗2 min后开始染色；苏木素液染色15 min后自来水冲洗，分化液分化30 s、自来水浸泡5 min；伊红染液染色1min后，自来水冲洗，浸泡5min；将切片放入梯度乙醇中脱水，风干后中性树胶封片。

1.3.2 采用Western blotting检测直肠组织TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表达量

称取各组大鼠100 mg直肠组织，置于匀浆器，将其剪碎；加入1 mL RIPA裂解液，10 μL PMSF，研磨碾碎组织；将研磨后的组织置于冰上裂解1 h后，裂解液移至离心管，12 000 r/min离心条件离心15 min，分离上清液，-80 ℃保存；采用BCA蛋白定量测定法测定蛋白总浓度。采用Western blotting技术检测直肠组织中TGF-β1相关蛋白表达情况，首先SDS-PAGE 凝胶电泳，湿法转膜至PVDF膜，摇床低速室温封闭2 h；将PVDF膜浸没在一抗中孵育，4 ℃过夜，GAPDH稀释比为1∶5 000，TGF-β1、Smad2、Smad3稀释比为1∶700；回收一抗后加入TBST摇床3次，将PVDF膜浸没在二抗中，摇床低速孵育1 h；加入TBST高速洗膜3次；将 PVDF 膜放在化学发光凝胶成像系统的黑色托盘上，曝光影像，采用开 Image Lab5.1 软件分析蛋白表达，以GAPDH为内参。

1.3.3 采用酶联免疫吸附法检测血清IL-2、IL-6、TNF-α水平

将血液标本3 000 r/min离心处理10 min后，分离血清，于-80 ℃冰箱保存备用。采用酶联免疫吸附法(贝克曼库尔特，AU5800全自动生化分析仪)检测炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α水平。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 直肠组织HE染色结果

肉眼观察：对照组大鼠直肠组织黏膜颜色粉红，未见明显的充血；模型组大鼠直肠组织黏膜颜色暗红，可见明显组织充血、肿胀及大小不等的溃疡点；TGF-β1组大鼠直肠组织外观较模型组明显改善；消痔灵组大鼠直肠组织黏膜颜色鲜红，接近对照组，轻度充血、水肿，溃疡斑点较少；TGF-β1联合消痔灵组大鼠直肠组织改善效果较消痔灵组有所改善。

显微镜观察：对照组大鼠直肠组织结构完整；模型组大鼠直肠黏膜上皮可见明显水肿及炎性改变，腺体结构不完整，组织损伤特征明显；消痔灵组大鼠直肠黏膜上皮未见明显水肿，腺体大部分细胞修复，腺体结构基本完整，仅黏膜下组织轻度充血；TGF-β1组大鼠直肠组织结构较模型组优，与TGF-β1联合消痔灵组比较有显著差异，联合消痔灵注射液治疗能进一步改善大鼠病理改变，见图2。

图2 各组直肠组织HE染色结果(HE×200) A：对照组；B：模型组；C：消痔灵组；D：TGF-β1组；E：TGF-β1联合消痔灵组

2.2 各组TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表达量比较

模型组直肠组织TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05)；消痔灵组、TGF-β1组、TGF-β1联合消痔灵组直肠组织TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表达量显著低于模型组(P<0.05)；TGF-β1联合消痔灵组直肠组织TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表达量显著低于消痔灵组、TGF-β1组(P<0.05)；消痔灵组直肠组织TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表达量与TGF-β1组比较无统计学意义(P>0.05)，见表1、图3。

表1 各组TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达量

图3 各组TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表达 A：对照组；B：模型组；C：消痔灵组；D：TGF-β1组；E：TGF-β1联合消痔灵组

2.3 各组炎症因子IL-2、IL-6、TNF-α水平比较

模型组血清IL-2、IL-6、TNF-α水平显著高于对照组(P<0.05)；消痔灵组、TGF-β1组、TGF-β1联合消痔灵组血清IL-2、IL-6、TNF-α水平显著低于模型组(P<0.05)；TGF-β1联合消痔灵组血清IL-2、IL-6、TNF-α水平显著低于消痔灵组、TGF-β1组(P<0.05)；消痔灵组血清IL-2、IL-6、TNF-α水平与TGF-β1组比较无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组炎症因子IL-2、IL-6、TNF-α水平

2.4 便血疗效分析

对照组大鼠及其它四组大鼠照射前大便次数正常，质地较硬，未见便血等情况。照射第2天内出现稀便、黏液脓血便，大便潜血检测均先后呈阳性。便血检测呈阴性(-)、可疑阳性(±)视为治疗有效，呈阳性(+)、中等阳性(++)及强阳性(+++)为治疗无效。消痔灵组、TGF-β1组、TGF-β1联合消痔灵组大鼠便血疗效分别为75.00%、50.00%、87.50%，见表3。

表3 便血疗效分析 [n(%)]

3 讨论

RP是腹腔、盆腔肿瘤放射治疗后出现的一种并发症，是肠道非特异性炎症。西医治疗RP以镇痛、止血、抗感染及减轻胃肠道痉挛等对症治疗为主，同时辅以饮食、肠道营养治疗及高压氧治疗[6]。中医通过分析该病腹泻、便血及腹痛三大主要症状，结合高能电离辐射病因，将其归为“泄泻”范畴[7]，认为该病病位在肠，病因为高能电力辐射，病机为热毒蕴结致使脾胃肠道受损。故中医治疗多以清热燥湿止血、凉血滋阴养血为原则，在此基础上根据病情变化加减[8]。消痔灵注射液为中成药，主要成分为五味子提取物、明矾等，具有消炎、抑菌、收敛、止血功效。该药含有鞣酸、低分子右旋糖酐、枸橼酸钠、亚硫酸氢钠等化学成分，对静脉曲张性混合痔出血具有较好疗效，可使用药区局部组织出血性坏死，进而发挥止血作用[9]。

近年来，精准医学的提出使综合性分析RP病理机制成为重点，致力于研究该病治疗方法在分子水平的作用机制。TGF-β是一种促纤维化因子，能诱导成纤维细胞增殖分化。研究表明，TGF-β及其信号通路在动物肠道疾病发生发展中发挥重要调控作用，可通过调节干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素(Interleukin，IL)的信号传导，抑制肠道炎症的发生[10]。Smads蛋白家族是TGF-β家族信号传导的主要介质，是TGF-β受体直接作用底物，TGF-β/Smad信号通路表达异常及失常会导致机体免疫抑制性功能障碍[11-12]。TGF-β1作为TGF-β家族中的重要一员，在细胞增殖、凋亡、迁移及炎症反应中发挥重要作用。多项研究报道[13-14]，放射治疗患者血清中TGF-β1水平与组织放射性损伤有关。Smads介导的TGF-β信号途径及其生物学效应，在放射性组织损伤中起至关重要的作用[15-17]。GTGF是一种多肽，TGF-β/Smad通路下游重要靶基因，研究证实[18-19]，TGF-β可通过TGF-β/Smad通路促进下游GTGF的表达，进而促进炎症反应发生。

为探究消痔灵注射液介导TGF-β1/Smad通路治疗RP的分子机制，本研究制作了RP大鼠模型，模型大鼠在照射后出现精神疲惫、反应迟钝、活动减少及便血等症状；另外直肠组织黏膜颜色暗红，明显组织充血、肿胀，且直肠组织TGF-β1表达量较正常对照组显著上升，说明大鼠RP模型制作成功。消痔灵组TGF-β1、Smad2/3蛋白表达较模型组显著下降，提示消痔灵注射液有抑制TGF-β1、Smad2/3的表达作用。采用TGF-β1抑制剂干预RP模型大鼠，发现其TGF-β1、Smad2/3蛋白表达较模型组显著下调，在此基础上采用消痔灵注射液治疗，发现直肠组织中TGF-β1、Smad2/3蛋白表达量与抑制剂组比较无显著差异，进一步提示消痔灵注射液主要通过介导TGF-β1/Smad信号通路发挥抗RP出血作用。TGF-β还能聚集炎症细胞，促进释放大量炎性细胞因子，如TNF-α、IL-4、IL-6、IL-13等[20]。本研究发现，模型组大鼠血清中IL-2、IL-6、TNF-α水平较正常对照组显著上升，TGF-β1组炎性因子水平较模型组有所下降，消痔灵组和TGF-β1联合消痔灵组大鼠血清炎性因子水平均明显下降，但组间比较有显著差异，后者下降水平更加明显，说明消痔灵注射液可通过TGF-β1/Smad信号通路在RP出血中发挥抗炎作用；TGF-β1联合消痔灵组炎性因子下降水平较TGF-β1组明显，提示消痔灵注射液还可能通过其他信号途径发挥抗炎作用。照射前各组大便质地较硬，未见便血，照射后出现黏液脓血便，大便潜血检测均先后呈阳性，消痔灵注射液及TGF-β1抑制剂干预后，各组大鼠便血情况得到改善，消痔灵组和TGF-β1联合消痔灵组疗效较高，有效率分别为80%、90%，提示消痔灵注射液可能通过其他通路或者机制治疗RP，但具体机制有待进一步研究。

综上所述，消痔灵注射液能够下调RP组大鼠直肠组织中TGF-β1、Smad2/3表达，该药治疗治疗RP出血主要通过介导TGF-β1/Smad信号通路发挥作用，但其具体药理作用机制仍需进一步探究。