滑动弧放电等离子体对枯草芽孢杆菌的灭菌机理

崔鲁彬，孙运金，2，王雪莹，王 艳

(1.北京农学院，北京 102206；2.北京农学院首都农产品安全产业技术研究院等离子体工程中心，北京 102206；3.中国农业机械化科学研究院，北京 100083)

0 引言

等离子体是由一种或几种电子、离子、光子及处于中性的粒子所构成的部分或全电离的离子化气体状物质[1-2]。根据等离子产生条件，等离子体可分为高温等离子体与低温等离子体两种，高温等离子体的电子温度和离子温度相等，可高达10 000 K[3-4]。相比之下，低温等离子体的电子温度虽在10 000 K左右，但离子温度接近环境温度，整体上呈现为室温，可直接应用于处理热敏物质[5]。同时，低温等离子体放电会产生大量活性氧、活性氮等活性成分，这些活性成分对细菌、真菌和孢子均有一定灭活作用，可应用于食品杀菌、农业育种和污染治理等领域[6-11]。

低温等离子放电具有多种产生方式，包括滑动弧放电、介质阻挡放电(DBD)、等离子体射流和电晕放电等[12-17]。因激发方式不同，等离子体产生的活性粒子种类和抑菌效果具有较大差异。目前大气等离子体放电模式主要有DBD放电、等离子体射流和滑动弧放电。MENDES-OLIVEIRA G等[18]采用DBD方式对枯草芽孢杆菌处理120 s，灭活效果超过了6个对数值，并且通过试验发现导致孢子失活的主要活性气体为臭氧。HUANG Y H等[19]采用DBD方式对枯草芽孢杆菌灭活，发现芽孢失活率取决于初始芽孢浓度和芽孢的处理时间，但对等离子体中活性物质的组分缺乏深入研究。ROTH S等[20]采用DBD方式灭活枯草芽孢杆菌，发现紫外线辐射在孢子失活过程中起主导作用，并且枯草芽孢杆菌的孢子是通过蛋白质失活和DNA损伤的共同作用而被灭活的。由此可知，介质阻挡放电的优势是放电面积较大，杀菌的主要活性成分为臭氧离子，而等离子体射流产生活性物质更加复杂。HERTWIG C等[21]采用射频等离子射流设备对枯草芽孢杆菌进行灭活，发现实现杀菌作用的活性物质为活性氧。REINEKE K等[22]采用纯氩气作为等离子体射流设备的气源，通过放电处理5 min后能降低芽孢杆菌约3个对数值，向纯氩气中通入一定比例的氧气与氮气能有效增强紫外光的发射强度。HONG Y F等[23]使用氦气与氧气的混合气体作为等离子体射流设备的气源，在放电40 s时灭活大肠杆菌约6个对数值，放电120 s后能减少枯草芽孢杆菌约5个对数值，证明了氧自由基(ROS)对细菌具有较强灭活性。PINA-PEREZ M C等[24]采用表面微放电装置对枯草芽孢杆菌进行了灭活，在等离子体功率5 mW/cm2时需要放电处理7 min才能降低约4个对数值。

相较于DBD和等离子体射流放电等离子体，滑动弧放电作为一种介于热等离子体和冷等离子体之间的温性等离子体，兼具热等离子体和冷等离子体的特性，具有装置成本低、结构简单、应用灵活和容易控制等特点，具有较高离子电离率和抑菌效率[25-28]。MOREAU M等[29-30]采用滑动弧放电方式进行杀菌工艺探索，结果表明，滑动弧放电杀菌具有多个阶段，前期放电过程中活细菌数量较稳定，在30 s内存活细菌数量会迅速减低10个对数值，但对滑动弧放电的杀菌机制缺少系统研究。由此可见，等离子体因激发模式的不同，会导致杀菌效率存在差异，对应的杀菌机制更加复杂。相对其他放电模式，滑动弧放电在放电面积和杀菌效率方面具有一定优势，现阶段对于滑动弧放电杀菌机理与活性有效成分的鉴别不够全面，本研究采用滑动弧放电等离子体放电处理枯草芽孢杆菌，通过改变输入气体的组分来探究滑动弧放电等离子体的杀菌效果与机理，明确其主要杀菌成分，为滑动弧等离子体的研究与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCCIC10275)，北京农学院食品学院微生物实验室；胰蛋白胨、酵母浸粉，华中海威(北京)基因科技有限公司；平板计数琼脂(PCA)，北京奥博星生物技术有限责任公司；叔丁醇(分析纯)、戊二醛，国药集团化学试剂有限公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

滑动弧放电等离子体装置，实验室自制；PG-1000ZF型等离子体电源(南京苏曼等离子科技有限公司)；JEOL JSM-6700F型冷场发射扫描电子显微镜(日本电子株式会社，JEOL)；HQ30d型便携式数字化多参数分析仪(美国哈希公司，HACH)；FV1000MPE型多光子激光扫描显微镜(日本奥林巴斯，Olympus)；FACS Aria Ⅲ型六激光十八色流式细胞分析分选系统(美国碧迪公司，BD)。

1.3 试验方法

1.3.1滑动弧放电设备

滑动弧放电等离子体装置主要由等离子体反应器(两个长度95 mm、直径4 mm的平行铜电极和外包陶瓷管)和可调节功率交流高压电源组成，搭建的试验设备如图1所示。电源输入工作频率50 Hz，两电极间距1.0 cm，接入电源后，气体(空气、氧气和氮气)从陶瓷管顶部进入通电的两电极之间形成弧光放电羽状区(放电面积100 mm×50 mm)。

1.等离子体电源 2.高压线 3.气体流量计 4.气瓶 5.空气压缩机 6.陶瓷管 7.等离子体羽辉 8.等离子体射流 9.铜电极图1 滑动弧放电等离子体装置Fig.1 Gliding arc discharge plasma device

1.3.2枯草芽孢杆菌菌悬液制备

枯草芽孢杆菌(CCIC10275)冻干粉标准菌株在无菌条件下经菌株复溶、复壮和传代各步骤得到第3代培养菌，用无菌的甘油与去离子水1∶1混合液在-20 ℃保藏菌种。每次使用前，将此菌种以1%～2%的接种量接种至PCA液体培养基(0.5 g胰蛋白胨、0.25 g酵母浸粉、0.1 g葡萄糖和100 mL去离子水)，于水浴恒温振荡器37 ℃、180 r/min培养12～18 h直至对数生长期，此时采用无菌生理盐水梯度稀释至103后由平板计数法测定得出[31-32]。

1.3.3滑动弧放电处理

移取100 μL的枯草芽孢杆菌菌悬液至装有20 mL PCA固体培养基的培养皿中，用无菌三角涂布棒均匀涂布至完全变干，盖上培养皿盖，用记号笔标记菌种名称、气体种类、处理时间及制备日期。同时使用85%生理盐水对原枯草芽孢杆菌菌悬液进行10、102、103和104梯度稀释、计数。每组处理结果取3个平行的平板平均值。将上一步制备好的枯草芽孢杆菌样品放置在距滑动弧放电装置放电下方1～2 cm处，分别将3种气体(空气、氮气和氧气)的流量调节为0.3 L/min，调整放电功率800 W，对枯草芽孢杆菌进行不同时间(0、5、10、15、20和25 s)的灭菌处理。

1.3.4菌落总数测定

将上述处理完的培养皿倒置于恒温(37±0.1 ℃)培养箱培养16 h，依据GB 4789.2—2010菌落总数测定法中平板计数法对菌落总数进行计数[32]。

1.3.5扫描电镜样品前处理

将枯草芽孢杆菌菌悬液进行多次0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗脱离心处理(8 000 r/min离心3 min、温度4 ℃)，沉淀物涂于无菌载玻片上自然晾干，置于不同气体的滑动弧放电中进行灭活处理，处理后的枯草芽孢杆菌样品用0.1 mol/L PBS进行冲洗收集，获得的收集液采用相同参数离心处理，将离心所得沉淀物加入400 μL戊二醛溶液在-4 ℃条件下固定12～16 h[33]。固定后的样品使用0.1 mol/L PBS进行3次洗涤，将1%的锇酸和0.1 mol/L PBS混合液与洗涤后样品混合染色固定2 h，重复3次PBS缓冲液洗涤，进行多次乙醇梯度脱水(乙醇的体积比例分别为10%、30%、50%、70%、90%、95%、100%和100%)[34]。脱水后样品采用叔丁醇3次置换处理，通过冷冻干燥机干燥成粉后电镀喷金，采用电子显微镜分析处理。

1.3.6电导率测试样品前处理

将枯草芽孢杆菌菌悬液进行多次0.1 mol/L磷酸盐缓冲液洗脱离心处理(10 000 r/min离心5 min、温度4 ℃)，沉淀物涂于无菌载玻片上自然晾干，置于不同气体的滑动弧放电装置中进行处理，将处理后枯草芽孢杆菌样品用1 mL(0.1 mol/L)PBS进行冲洗收集，并用无菌水定容至20 mL，采用电导仪对定容后的菌液进行电导率测定。

1.3.7激光共聚焦激光扫描显微镜样品前处理

将上述制备好的枯草芽孢杆菌菌悬液进行多次0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗脱离心处理(5 000 r/min离心5 min、温度4 ℃)，沉淀物涂于无菌载玻片上自然晾干，置于不同气体的滑动弧放电装置中进行灭活处理，处理后的枯草芽孢杆菌样品用0.1 mol/L PBS进行冲洗收集，获得的收集液采用相同参数离心处理2～3次，将离心所得沉淀物分别加入100 μL Binding buffer、5 μL V-FITC探针和10 μL PI探针，混匀后避光反应静置15 min再加入400 μL Binding buffer，滤膜过滤上机处理。

2 结果与讨论

2.1 灭菌效果

为分析不同的放电气体对枯草芽孢杆菌的杀菌效果，采用3种不同气体(空气、氧气和氮气)来确定杀菌的有效性和差异性。通过改变放电时间形成放电等离子体处理枯草芽孢杆菌，结果如图2所示。由图2可知，不同放电气体对枯草芽孢杆菌的杀菌效果差异较大。空气放电的杀菌效果最差，随着杀菌处理时间延长至25 s时，菌落总数从3.9 cfu/mL降低至0.3 cfu/mL。氧气的杀菌效果相对较好，在杀菌处理时间至25 s时菌落总数最大可降至0 cfu/mL。氮气的杀菌效果最好，在杀菌处理时间至20 s时菌落总数可降低至0 cfu/mL，降低了约4个log值。结果表明，处理时间越长，杀菌率越高、杀菌效果越明显。

图2 不同气体处理对枯草芽孢杆菌的杀菌效果随放电时间的变化Fig.2 Inactivation effects of Bacillus subtilis with discharge time under different gas treatment

2.2 表面形貌

不同气体放电处理后，枯草芽孢杆菌的表面形貌如图3所示。未处理样品表面较为光滑，没有褶皱和缺陷，成完整杆状结构，如图3a、3d和3g所示。与对照组相比，经空气放电处理10 s后少数枯草芽孢杆菌出现皱缩现象，如图3b所示。在空气放电处理25 s时，绝大多数枯草芽孢杆菌出现孢子结构的破碎与缺陷，杆状结构被破坏，如图3c所示。当放电气体改为氧气或氮气时，在放电处理10 s后多数枯草芽孢杆菌表面出现皱缩现象，氮气处理组个别枯草芽孢杆菌甚至出现破碎现象，如图3e、3h所示。当放电时间延长至25 s时，枯草芽孢杆菌杆状结构被大量破坏，原有结构被完全破碎，如图3f、3i所示。不同气体所导致的枯草芽孢杆菌表面形貌存在一定差异，这可能是由于不同气体放电形成的活性成分不同所致，造成细胞膜结构的破裂可能是由于·OH自由基团对细胞膜脂类物质的强氧化性造成的[30]。

图3 等离子体处理前后枯草芽孢杆菌表面形貌Fig.3 Representative SEM images of Bacillus subtilis before and after plasma treatment

2.3 菌液电导率

不同种类放电气体形成的等离子体处理，对枯草芽孢杆菌菌液电导率的变化影响如图4所示。氧气和空气等离子体处理枯草芽孢杆菌菌液电导率的结果差别相对较小，但电导率都在处理10 s前有不同程度的增长，10～25 s内电导率出现连续下降，在25 s时达到最小值537.5 μs/sm。对枯草芽孢杆菌菌液电导率影响最大的气体是氮气，在等离子体处理10 s后，枯草芽孢杆菌菌液电导率达到最大值820 μs/sm，其电导率相较于初始时电导率增加了254.5 μs/sm。

图4 不同气体的等离子体处理前后菌液电导率的变化Fig.4 Conductivity variation of bacterial solution before and after plasma treatment under different gas treatment

结合图3等离子体处理25 s时的扫描电镜图像可知，电导率的变化趋势在初始阶段呈现上升现象，可能原因是来自等离子体放电中的活性物质对细胞膜产生了一定氧化刻蚀作用，随处理时间增加而增强。当处理时间超过10 s后，滑动弧放电产生了热量积累效应，在破坏细胞膜的同时也导致胞内物质的过快蒸发而损失，从而降低了菌液的电导率[35]。

2.4 细胞凋亡

为深入了解等离子体放电对枯草芽孢杆菌的杀菌机理，对样品进行了激光共聚焦显微镜分析，检测结果如图5所示(a、b和c为对照组样品，d、e、f/g、h、i为处理组样品，处理时间分别为10 s和25 s)。当细胞处于活性阶段时，FITC和PI探针无法对其细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸进行染色标记，因此在激光共聚焦显微镜照射中无荧光反应。但在早期凋亡的细胞中的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)从细胞膜内侧翻转至细胞膜表面，此时PS就会与FITC探针进行高亲和力结合，在激光共聚焦显微镜照射中呈绿色荧光反应，而凋亡晚期或坏死的细胞由于细胞膜的不完整性，会被另一种探针PI探针染色，在激光共聚焦显微镜照射中呈红色荧光反应。

未经过等离子体处理的枯草芽孢杆菌在FITC和PI探针双重染色后未出现绿色或红色的荧光反应，证明其菌体活性强且细胞膜完整，如图5a和5b所示。当等离子体处理10 s后，通过激光共聚焦显微镜发现了少量由FITC探针染色的绿色荧光反应，与较多的由PI探针染色的红色荧光反应，证明了等离子体会导致细胞的凋亡、破坏细胞膜的完整性，如图5d和5e所示。在等离子体处理25 s时，呈红色荧光反应(细胞凋亡)的枯草芽孢杆菌数量明显增多，如图5g和5h所示。通过对比3种气体放电处理后的红色荧光强度与数量可以发现经过氮气等离子体处理后的样品凋亡率高于氧气与空气处理组。因此，可以推断，滑行电弧放电会对膜的通透性和完整性造成积极破坏，导致细胞坏死。

由上述研究结果发现，滑动弧放电等离子体灭菌效果与滑动弧放电产生的活性成分紧密相关，如ROS/RNS类活性物质积极参与并主导了枯草芽孢杆菌的灭活，这与大多数研究结论相类似[36-37]。根据杀菌效果来看，活性氮类物质杀菌的重要性超过了活性氧物质，并且滑动弧放电所产生的活性物质会随时间变化而增多，且主要灭活枯草芽孢杆菌的机理是以RNS为主的活性物质对枯草芽孢杆菌膜结构造成了严重的蚀刻和侵蚀作用，使其内部遗传物质暴露于等离子体物质照射下导致遗传物质被分解氧化[38-39]。

3 结束语

本文研究了滑动弧放电等离子体处理对枯草芽孢杆菌的失活效果，在氮气、空气和氧气放电条件下，氮气的杀菌效果较好，在15 s的处理时间内可降低4个对数值。通过表面形貌和电导率测试进一步分析了该技术的灭菌机理，滑动弧放电等离子体处理对细胞壁造成了氧化性刻蚀作用，导致细胞壁破损，并通过细胞流式测试进一步验证了膜的完整性被破坏，导致细胞坏死。该技术为新型杀菌技术提供了一种新的选择，在杀菌消毒和食品储藏保鲜领域具有较好的应用前景。