生 盐知母水煎液中芒果苷在大鼠体内的组织分布△

唐雅楠，许金凯，韩喜桃，韩舒，刘凯洋，支美汝，刘子琴，李卫飞，李飞，杜红

北京中医药大学 中药学院，北京 102488

知母来源于百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根茎，味苦、甘，性寒，归肺、胃、肾经，具有清热泻火、生津润燥的功效[1]。盐知母是知母历代的主流炮制品种，传统理论认为，盐炙可引药入肾[2]。本课题组前期实验与文献报道也表明，知母盐炙后滋阴降火作用增强[3-8]。

芒果苷是知母有效成分之一，也是《中华人民共和国药典》2020年版规定的质量控制成分之一[9]，具有抗炎[10-15]、保护肾功能[16-18]、增强免疫力[19-20]、抗病毒[21]、抗氧化[22-23]等作用。在炮制过程中，利用辅料与药物相辅或相制的性味，可达到调整药性、引药归经、影响药物作用趋向、增强临床疗效的目的。陈嘉谟在《本草蒙筌》中记载：“酒制升提，姜制发散，入盐走肾脏仍仗软坚……”[24]，明确提出盐炙入肾理论。本实验通过研究生、盐知母水煎液中芒果苷在大鼠体内的组织分布，以期从辅料作用论角度探讨知母盐炙后滋阴降火作用增强的机制。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，40只，雄性，体质量(200±20) g，由北京斯贝福生物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK-2016-0002。动物饲养于北京中医药大学屏障环境动物实验室[动物使用许可证号：SYXK(京)2016-0038]，室温(25±2) ℃，相对湿度为45%，12 h/12 h 光暗周期。实验开始前进行适应性饲养3 d。

1.2 试药

知母饮片购于北京双桥燕京饮片厂，批号：1611103558，经北京中医药大学中药鉴定与资源系王晶娟副教授鉴定为百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根茎。盐知母为本实验室自制，工艺条件为取知母饮片100 g，加盐水拌匀，闷透，在160～170 ℃条件下炒制20 min。每100 kg知母片用食盐2 kg。

对照品芒果苷(上海源叶生物技术有限公司，批号：Y26M8H369263，纯度≥98%)；乙腈(色谱纯，Fisher公司)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，天津市福晨化学试剂厂)；甲醇、冰乙酸(色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司)；0.9%氯化钠溶液(石家庄四药有限公司，批号：1901013202)；水为超纯水。

1.3 仪器

2965型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；BY-R20型高速冷冻低温离心机(北京白洋医疗器械有限公司)；FA1104B型分析天平(上海越平科学仪器有限公司)；ISO9001型十万分之一天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；RE-52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；VORJEK5型涡旋震荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；MTN-5800型氮吹浓缩装置(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：SunFire C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.2%乙酸水溶液，梯度洗脱(0～8 min，15%～25%A；8～12 min，25%A；12～15 min，25%～80%A；15～20 min，80%～15%A；20～25 min，15%A)；流速为1.0 mL·min-1；柱温为25 ℃；进样体积为20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取芒果苷对照品1.02 mg，于10 mL量瓶中用甲醇定容，得质量浓度为102 μg·mL-1的对照品溶液，4 ℃下保存备用。

取适量芒果苷对照品溶液，用甲醇水溶液(40∶60)稀释，得到质量浓度为2 μg·mL-1的对照品稀释液，4 ℃下保存备用。

2.2.2供试品溶液的制备 芒果苷混悬液：取CMC-Na适量，加入一定量水，混匀，得到0.5%的CMC-Na混悬液。精密称取芒果苷0.5 g，加入CMC-Na混悬液定容至25 mL，得到质量浓度为20 mg·mL-1的芒果苷混悬液。

知母水煎液：取生知母和盐知母各100 g，10倍量水浸泡30 min后加热回流 1 h，4层纱布滤过后，药渣加8倍量水同法得二次滤液，合并药液，浓缩，得以生药量计质量浓度为1 g·mL-1的生、盐知母水煎液(以芒果苷计分别为6.4、9.7 mg·mL-1)。

2.3 组织样品收集

SD雄性大鼠40只，随机分为对照组、芒果苷(200 mg·kg-1)组、生知母(10 g·kg-1)组、盐知母(10 g·kg-1)组，每组10只，灌胃给药前禁食12 h，可自由饮水，分别灌胃给予水、芒果苷混悬液、生知母水煎液和盐知母水煎液，给药量为10 mL·kg-1。灌胃2 h后处死，迅速取出肝、心、脾、肺、肾，用0.9%氯化钠溶液冲洗干净，滤纸擦干。精密称取各组织0.5 g，用0.9%氯化钠溶液制成25%组织匀浆，于-80 ℃下保存。

2.4 组织样品处理

精密吸取200 μL组织匀浆于2 mL离心管中，加入600 μL乙腈乙酸溶液(40∶1)，充分振荡1 min，4 ℃、13 000 r·min-1离心20 min(离心半径为8.5 cm)，取上清液，35 ℃水浴氮气吹干，残渣加入200 μL甲醇水溶液(40∶60)复溶，离心，上清液滤过后进HPLC检测。

2.5 统计方法

2.6 方法学验证

2.6.1专属性考察 取大鼠空白肾组织匀浆液、含芒果苷空白肾组织匀浆液、灌胃生知母水煎液后肾组织匀浆液，按2.4项下方法处理，按照2.1项下色谱条件进行分析，结果见图1。色谱峰峰形良好，无杂峰干扰测定，专属性良好。

注：A.空白肾组织；B.含芒果苷空白肾组织；C.灌胃生知母水煎液后肾组织。图1 大鼠肾组织中芒果苷色谱图

2.6.2标准曲线及定量下限考察 分别精密吸取2.2.1项下对照品稀释液5.14、10.53、22.22、50.00、85.72、133.34、200.00 μL及对照品溶液6.18、12.78 μL，加入大鼠各空白组织匀浆200 μL，得质量浓度约为50、100、200、400、600、800、1000、3000、6000 ng·mL-1的系列组织匀浆样品。按2.4项下方法处理，2.1项下色谱条件检测，建立标准曲线，得各回归方程见表1，芒果苷在各组织匀浆中线性范围为50～6000 ng·mL-1，定量下限为50 ng·mL-1，且线性关系良好，r≥0.999 3。

表1 芒果苷在大鼠各组织中的线性关系

2.6.3精密度和准确度考察 按2.6.2项下方法操作，每日制备含有低、中、高质量浓度(50、600、6000 ng·mL-1)芒果苷的大鼠组织匀浆各6份，日内连续进样，连续测定3 d。精密度以日内质量浓度和日间质量浓度的RSD表示，准确度以测得的实际质量浓度与配制质量浓度的比值表示。结果显示，各组织匀浆中芒果苷测定的准确度在89.59%～101.11%，日内精密度的RSD≤8.65%，日间精密度的RSD≤13.84%。

2.6.4提取回收率和基质效应考察 按2.6.2项下方法操作，制备含有低、中、高质量浓度(50、600、6000 ng·mL-1)芒果苷的大鼠组织匀浆各6份，按照2.4项下方法处理，2.1项下方法进样检测，得到峰面积A1。取空白组织匀浆200 μL，按2.4项下方法操作至氮气吹干，残渣用含低、中、高3个质量浓度芒果苷的甲醇水溶液(40∶60)复溶，按照2.1项下方法进样检测，得到峰面积A2。直接用含低、中、高3个质量浓度芒果苷的甲醇水溶液进样分析，得峰面积A3。按照公式(1)～(2)计算提取回收率和基质效应。

提取回收率=A1/A2×100%

(1)

基质效应=A2/A3×100%

(2)

结果显示，提取回收率为58.06%～95.46%，RSD<15%，基质效应为71.43%～103.03%，RSD<12%，表明测定方法提取回收率良好，无基质干扰。

2.6.5稳定性考察 取含有低、中、高质量浓度(50、600、6000 ng·mL-1)芒果苷的大鼠空白组织匀浆，按照2.4项下方法处理，考察样品在室温下放置3、24 h和冻融3次的稳定性，结果显示，各条件下各组织匀浆中芒果苷的稳定性为89.18%～105.06%，RSD<11%，表明芒果苷在各条件下稳定性较好。

2.7 芒果苷组织分布结果

灌胃芒果苷混悬液2 h后，大鼠各组织中芒果苷含量为肺>肾>脾>心≈肝。灌胃生、盐知母水煎液2 h后，大鼠各组织中芒果苷含量为肺>肾>脾>肝>心(图2)。生、盐知母水煎液组与芒果苷组的分布规律相同，符合知母的归经特点。生、盐知母水煎液中芒果苷在大鼠各组织中的含量均高于芒果苷组，但生、盐知母水煎液中芒果苷在大鼠各组织中的含量差异无统计学意义。

注：与芒果苷组对应组织比较，*P<0.05。图2 芒果苷组及生、盐知母水煎液组大鼠各组织中芒果苷质量分数

3 讨论

本实验研究了给予生、盐知母水煎液和芒果苷混悬液后大鼠体内芒果苷在各组织的分布情况，结果表明，芒果苷主要分布在肺、肾中，该结论与知母的归经特点一致。芒果苷在肺、肾组织中的含量依次为盐知母水煎液≈生知母水煎液>芒果苷混悬液。由灌胃剂量可知，芒果苷组的灌胃剂量(以芒果苷质量分数计)分别是生、盐知母组的3.1、2.1倍(实验用饮片中生知母芒果苷质量分数为0.64%，盐知母芒果苷质量分数为0.97%)，其芒果苷在各组织中的含量却显著小于生、盐知母组，一方面可能是由于饮片在煎煮过程中促进芒果苷溶出或产生其他成分向芒果苷转化，使水煎液中芒果苷含量增加；另一方面，中药饮片中化学成分复杂，其他成分可能促进了芒果苷的溶出和吸收。盐知母组大鼠肾脏组织中的芒果苷含量与生知母组相比差异无统计学意义。说明单以芒果苷的分布阐明盐炙入肾的炮制理论尚没有充分的科学依据，知母盐炙后增强滋肾阴作用及作用机制需进一步探讨。