罗布麻茎叶粗提物及脱胶纤维的抑菌活性分析

刘宁，哈尼帕·哈再斯，喻春明，陈平，陈继康，陈坤梅，王晓飞，Aminu Shehu Abubakar，高钢*，朱爱国*

（1.中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205）

（2.新疆伊犁州农业科学研究所，新疆 伊宁 835000）

我国可开发利用的夹竹桃科罗布麻属（Apocynum）植物资源主要有罗布白麻（ApocynumhendersoniiHook.f.）和罗布红麻（ApocynumvenetumL.）两种［1］，他们具有相似的植物形态、生理特性以及类似的经济属性［2-4］。罗布麻属植物生态适应性强，具有较强的生态和经济双重效益。根、茎、叶、花、全草可入药，有平心悸、止眩晕、消痰止咳、强心利尿等功效［5-7］；茎部韧皮纤维是纺织、造纸的优质原料，并具有良好的保健与抑菌性能［8-9］；叶子可制成保健茶等［10］。近年来，在回归自然思潮的影响下，罗布麻产品的开发利用如火如荼。

罗布麻茎、叶中含多种抑菌成分，其中的蒽醌、黄酮类、β-谷甾醇以及鞣质等酚类对微生物的抑制和杀灭起主要作用［11］，如黄酮等酚类化合物分子中的酚羟基能与细菌或真菌中的蛋白质或酶以氢键方式结合，促使蛋白质变性，导致细胞质解体和细胞膜皱缩等［12］，从而有效地抑制微生物的生长［13］。当前，罗布麻脱胶纤维的生产和加工方法与苎麻等其他麻类作物较为相似，植株茎秆上的韧皮需经剥离、蒸煮、脱胶等系列精细化生产后才可获得理想的纺织纤维，韧皮剥离过程中产生大量的茎叶副产物。为此，本文主要研究罗布麻脱胶纤维以及韧皮纤维剥离过程中产生的茎叶副产物的抑菌效果，旨在探索罗布麻非抗生素类天然产物的抑菌活性成分，并为罗布麻多用途利用和功能型纤维制品的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

罗布红麻和罗布白麻纤维均为脱胶处理后的精干麻纤维，罗布红麻茎叶采集于中国农业科学院麻类研究所国家种质麻类资源圃，罗布白麻茎叶采集于中国农业科学院西部农业研究中心昌吉试验基地。茎叶收集后于70℃烘箱中烘干30 min充分去除水分，置于破壁机中打碎至粉末状后过160目细筛，备用。

试验菌种：大肠杆菌（CCTCC AB 91117）、金黄色葡萄球菌（CCTCC AB 91093）和黄曲霉菌（ATCC 13450）。

1.2 试剂与主要仪器

胰蛋白胨（Trytone）和酵母粉（Yeast Extract）：Oxiod公司；氯化钠、氢氧化钠：99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉，PDA、PDB培养基：BR级，北京索莱宝科技有限公司。

电热恒温干燥箱（DGG-9030A）、Westinghouse多功能加热破壁机D16、精密分析天平（ME204，0.0001 g）、TOMY全自动高压灭菌锅（TOMY Autoclave）、AIRTECH超净工作台、电热恒温培养箱（DNP-9082型）、722 N可见分光光度计等。

1.3 试验方法

1.3.1 罗布麻茎叶粗提物抑菌活性测定

（1）罗布麻茎叶粗提物样品的制备

称取过细筛后的罗布红麻和罗布白麻茎叶粗提物，20%PEG-400+10%DMSO+70%生理盐水分别配制成15、20 mg/mL的悬浊液备用。

（2）培养基的制备

LB营养琼脂培养基：取950 mL去离子水于1 L的锥形瓶中，加入胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g，玻璃棒搅拌直至完全溶解，并加入1.0 mg/mL氢氧化钠调节pH至7.0左右，去离子水定容至1 L，于高压灭菌锅中121℃灭菌20 min备用（用于细菌培养）。

PDB培养基：取25 g PDB加入1 L蒸馏水后加热煮沸溶解，于高压灭菌锅中121℃灭菌20 min备用（用于真菌培养）。

固体培养皿：在液体LB培养基的基础上加入1.5%～2.0%琼脂粉，用于细菌固体培养；真菌固体培养采用PDA培养基，取40.1 g PDA于1 L蒸馏水中加热煮沸至完全溶解，于高压灭菌锅中121℃灭菌20 min，待灭菌完成后，均匀倒于一次性无菌培养皿中，厚度约0.5 cm，待冷却凝固后于4℃冰箱中保存待用。

（3）菌悬液的制备

将测试用的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种于LB固体培养基的培养皿中划线，37℃培养12 h；黄曲霉菌接种于PDA培养基中划线，于30℃培养12 h。取灭菌好的试管3支分别加入LB液体培养基和PDA培养基约5.0mL，用接种环挑取一环单菌落于试管中，放置于水浴摇床培养12 h。超净工作台上取少许活化的菌体置于试管中，稀释至相同浓度（约1.0×108CFU/mL）备用。

（4）抑菌活性检测

将经LB或PDB稀释后的不同菌液分别均匀涂布于固体LB或PDA一次性培养皿中，然后吸取不同浓度的罗布红麻和罗布白麻叶片粗提物悬浊液20μL，滴于直径为6 mm的滤纸片中心位置，静置2 min后，置于上述培养皿中，助溶剂为对照组，于恒温培养箱中37℃（细菌）或30℃（真菌）下培养12 h，采用游标卡尺测量抑菌圈直径［14］。每个菌种设置3个重复，取平均值，同时每组试验中，每个培养皿中放入5枚滤纸片，以中间放置无菌滤纸片的培养皿作为空白对照组。

采用对倍稀释法检测罗布红麻及罗布白麻茎叶粗提物溶液的最小抑菌浓度。将罗布白麻及罗布红麻茎叶粗提物溶液和3种菌种混合培养于无菌试管中，依次稀释并使粗提物终浓度分别为40、20、15、10、7.5、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mg/mL，且不同菌种终浓度保持一致，约1.0×108CFU/mL，每个处理均设置3个重复，助溶剂作为阳性对照组，培养基和生理盐水作为阴性对照组。于37℃（真菌30℃）孵箱中培养12 h后，肉汤澄清表示无细菌生长（-），浑浊表示有细菌生长（+），以能抑制细菌生长的药液浓度作为其MIC［15］。

1.3.2 罗布麻脱胶纤维抑菌活性定性测定

（1）琼脂平皿扩散试验方法

采用《GB/T 20944.3-2007纺织品抗菌性能的评价》方法定性评定罗布麻脱胶纤维对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能；采用《AATCC30-2004抗真菌活性：纺织品防腐和防霉性能评价》方法测定罗布麻脱胶纤维对黄曲霉的防腐和防霉性能。

（2）振荡法测定抑菌性试验方法

按照《GB/T 20944.3-2008纺织品抗菌性能的评价》第3部分振荡法标准执行。

1.3.3 数据处理与分析

各指标测定均重复3次。采用Excel 2019和SPSS 23.0进行数据采集和分析。

宪法的生命在于实施，宪法的权威也在于实施。如何让文本上的宪法在我省“活起来”“落下去”，充分发挥国家根本法的作用，是全省各级各部门的共同责任，地方各级人大及其常委会更是责无旁贷。当前，深入推进宪法学习宣传和贯彻实施，应着重把握好以下5个方面。

2 结果与分析

2.1 罗布麻茎叶粗提物抑菌性能

2.1.1 罗布白麻茎叶粗提物的抑菌活性

由表1和图1可知，罗布白麻茎叶粗提物对不同微生物的抑制活性与粗提物浓度呈正相关。对同一菌种，罗布白麻茎叶提取物抑菌圈直径随着浓度的升高而增加，其中大肠杆菌增加值最高，为5.330 mm，金黄色葡萄球菌次之，为4.735 mm，黄曲霉菌最小，约4.120 mm。同一浓度下，罗布白麻茎叶粗提物对不同微生物的抑制效果较为相似，均为对黄曲霉菌的抑制效果最佳（抑制圈直径分别为12.735、16.855 mm），金黄色葡萄球菌次之，大肠杆菌稍差。

图1 不同浓度罗布麻属植物茎叶粗提物的抑菌圈Fig.1 Inhibition zones of apocynum plants leaf and stem rough extract with different concentrations

表1 罗布白麻茎叶粗提物对不同菌种的抑菌圈直径Table 1 Inhibition zone diameters of different concentrations of A.hendersonii leaf and stem rough extract on different strains mm

2.1.2 罗布红麻茎叶粗提物的抑菌活性

由表2和图1可知，罗布红麻茎叶粗提物对不同菌种的抑制活性同罗布白麻，均随着浓度的升高而增加。其中，金黄色葡萄球菌增加值最高，为4.315 mm，黄曲霉菌次之，为4.170 mm，大肠杆菌最低，约为3.840 mm。同一浓度下，罗布红麻茎叶粗提物对不同微生物的抑制活性存在差异，抑菌圈直径大小情况为：黄曲霉菌＞金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌。

表2 罗布红麻茎叶粗提物对不同菌种的抑菌圈直径Table 2 Inhibition zone diameters of different concentrations of A.venetum leaf and stem rough extract on different strains mm

综上所述，不同罗布麻之间，罗布白麻粗提物对3种微生物的抑菌活性均大于罗布红麻。相同浓度下，两种罗布麻粗提物对不同微生物的抑制活性大小顺序相同，均为黄曲霉菌＞金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌。

2.1.3 罗布麻茎叶粗提物最小抑菌浓度测定

由表3可知，随着培养时间增加，培养基和生理盐水混合培养的阴性对照组处于澄清状态；加入助溶剂的阳性对照组的菌液浑浊程度不断增加，将不同质量浓度的罗布麻茎叶粗提物加入包含有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黄曲霉菌的培养液后其浑浊程度发生了明显的变化，说明罗布麻茎叶粗提物对不同菌种均有不同程度的抑制作用。其中，罗布白麻和罗布红麻茎叶粗提物对黄曲霉菌的最小抑菌浓度分别为5、7.5mg/mL，对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度相同，均为7.5mg/mL；而对大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为10、15 mg/mL。罗布麻茎叶粗提物在低于最小抑菌浓度下，同一样品不同浓度之间，菌种的生长密度随样品浓度的降低而增加，呈现一定的剂量依赖关系。

表3 罗布麻茎叶粗提物最小抑菌浓度（MIC）Table 3 Minimum inhibitory concentrations（MIC）of A.venetum leaf and stem rough extract on different strains

2.2 罗布麻脱胶纤维抑菌性能

2.2.1 琼脂平皿扩散法测定罗布麻脱胶纤维抑菌性能

通过琼脂平皿扩散法测试罗布麻脱胶纤维对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黄曲霉的抑菌圈发现，罗布红麻和罗布白麻纤维样品对大肠杆菌的抑菌圈直径大于10mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径小于10 mm，从定性试验结果初步推测，罗布红麻和罗布白麻脱胶纤维对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具一定的抑制能力，但对革兰氏阴性菌（大肠杆菌）的抑制效果稍优于革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）。罗布麻脱胶纤维置于黄曲霉琼脂平皿中培养3 d后，平皿中伴随有大量菌落繁殖，纤维附近形成抑菌圈。从定性试验结果初步推测，罗布红麻和罗布白麻纤维对黄曲霉的防腐、防霉性能不明显（见表4）。

表4 罗布麻脱胶纤维琼脂平皿扩散法抗菌效果评价Table 4 Evaluation on antibacterial effect of AGAR plate diffusion method of Apocynum venetum fiber

2.2.2 振荡法测定罗布麻脱胶纤维抑菌性能

由表5可知，罗布红麻纤维和罗布白麻纤维对供试大肠杆菌的抑菌率分别高达96%、95%，对金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为91%、89%，对黄曲霉的抑菌率则分别为10%和11%。罗布红麻纤维和罗布白麻纤维对供试金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的抑菌率均大于标准值（根据振荡法抗菌性能评价标准，对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抑菌率≥70%，样品具有抗菌效果），抑菌效果较为明显。

表5 罗布麻脱胶纤维震荡法抑菌性能结果Table 5 Results of bacteriostatic performance by shock method

3 结论与讨论

细菌细胞壁的结构在决定抗菌剂与微生物的相互作用之间发挥着关键作用［16］。革兰氏阳性菌的细胞壁存在较厚的肽聚糖层（15～100 nm），占整个细胞干重的40%～90%。除此之外，还含有大量的磷壁酸和少量的脂类与细胞膜紧密连接［17］。革兰氏阴性菌由细胞质膜和薄的肽聚糖层组成（20～50 nm），占整个细胞干重的5%～10%，但其细胞壁层次较多且成分复杂，并进一步受到由脂多糖组成的疏水性脂质双分子层保护，脂质层大大降低了其渗透能力［18］。由滤纸片-琼脂平皿抑菌试验结果可知，罗布麻茎叶粗提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黄曲霉3类菌体结构各异的微生物均具有抑制效果，且对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和真菌（黄曲霉）的抑制效果明显优于革兰氏阴性菌（大肠杆菌）。据此可推测罗布麻茎叶粗提物中抑菌成分可能对肽聚糖层的破坏能力相对较强且能穿过成分复杂的细胞壁，而对肽聚糖、脂类和磷壁酸作用能力相对较弱。分离这些活性物质并鉴定其分子结构，有可能发现具有新型杀菌活性的先导化合物。

真菌细胞壁结构特点区别于细菌，主要由几丁质、脱乙酰壳多糖、葡聚糖、纤维素、半乳聚糖等碳水化合物组成［19］。本研究发现罗布白麻和罗布红麻茎叶提取物对供试黄曲霉类真菌的最小抑菌浓度分别为5、7.5 mg/mL，抑制效果优于多种植物源抑制剂或精油［20］，这一结果对利用和开发罗布麻来源的天然黄曲霉抑制剂具有重要意义。

目前关于麻类纤维的抗菌机理主要如下：一是从纤维结构来说，麻类纤维内部含大量孔腔，可抑制厌氧菌的生长，并且具吸水快干的功能，破坏细菌生长的潮湿环境；从纤维成分来说，纤维中含有的某些活性成分具较好的抑菌、杀菌效果［21］。李明华等［22-24］从罗布麻原麻中分离鉴定了多种含量较高的黄酮类抑菌活性成分，但在脱胶后的纤维中未能发现黄酮化合物。罗布麻不同部位含有不同成分的抑菌活性物质，分别对不同类型的微生物具有抑制作用［25-27］。罗布麻原纤维经强酸强碱脱胶等加工工艺，去除果胶和木质素的同时，也导致纤维的有效抑菌成分明显减少和结构变化。本试验中，脱胶后的罗布麻纤维对黄曲霉类真菌的抑制效果与罗布麻茎叶粗提物相比显著降低，这也进一步支持了上述推测。此外，罗布麻脱胶纤维虽仍对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具一定的抑制效果，但相对于罗布麻茎叶粗提物，其抑制活性表现出一定的差异。因此，罗布麻脱胶纤维中存在的耐酸耐碱性抑菌物质或经强酸强碱作用生成的新抑菌物质还有待进一步发掘。