补肾活血法对系统性红斑狼疮合并动脉粥样硬化小鼠免疫功能和组织病理学的影响*

杨 月，田 园，陈玥颖，李永明，钟沈煜，薛 鸾

(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院风湿科，上海 200437)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)合并早发动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是严重影响SLE患者生存率的重要原因，日益受到关注。但是现代医学常用的糖皮质激素及免疫抑制剂的治疗存在诸多的副作用。中医药注重“整体论治”及“辨证论治”，根据系统性红斑狼疮和动脉粥样硬化共同的中医病机“肾虚为本，血瘀为标”，采用补肾活血法治疗可一举两得，在治疗系统性红斑狼疮合并动脉粥样硬化方面，中医药有着广阔的前景。课题组前期研究表明，补肾活血法通过降低血沉(ESR)、免疫球蛋白 G(IgG)、D-二聚体(D-Di)、纤维蛋白原(FIB)及24 h尿蛋白定量，对SLE患者早发动脉粥样硬化起到一定的预防作用。本研究拟进一步观察补肾活血法对SLE合并动脉粥样硬化模型鼠免疫功能和组织病理学的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

大雌性ApoE-/-小鼠45只和C57BL/6小鼠15只，8周龄，购自常州卡文斯实验动物有限公司，所有实验过程中小鼠均在上海中医药大学附属岳阳医院实验动物中心饲养,小鼠饲养于SPF级动物房,动物房温度、湿度恒定,温度21～22℃，湿度50%～60%。采用12 h(早7时-晚7时)明暗循环,小鼠清洁饮水,自由取食。本研究采用的动物试验方案经上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物福利与伦理会审查批准(批准号17722)。

1.2 中药组成及制备

中药浓缩颗粒由江阴天江药业有限公司提供。1 g制首乌浓缩颗粒相当于10 g制首乌生药，1 g蒲黄浓缩颗粒相当于20 g蒲黄生药。将上述浓缩颗粒按照下文所述比例混合后溶于沸水中，搅拌均匀，冷却至室温后使用。

1.3 造模及药物干预

8周龄大雌性ApoE-/-小鼠45只，给予一次性腹腔注射pristane 0.5 ml(购自百灵威科技有限公司)，继续喂养16周后随机分为3组各15只。中药治疗组：补肾活血中药(制首乌、蒲黄)，西药对照组：吗替麦考酚酯分散片(购自杭州中美华东制药有限公司，0.25 g/片)，模型组：生理盐水。

根据人与小鼠用药量体表面积等效公式，中药治疗组药物按照人体常用剂量(制首乌生药30 g，蒲黄生药15 g/d)比例换算成小鼠用量为制首乌生药0.13 g：蒲黄生药0.07 g/d，西药治疗组药物按照人体常用剂量(0.5 g/d)换算成小鼠用量为2.2 mg/d，模型组和正常对照组给予等体积生理盐水，4组小鼠每天2次灌胃，连续12 周。

1.4 主要仪器及设备

酶标仪(美国 BioTek)、全自动生化仪(上海科华)、普通光学显微镜(日本 Nikon)、组织包埋机(美国 Thermo)、石蜡切片机(德国 Leica)。

1.5 蛋白尿评估

使用小鼠代谢笼收集小鼠24 h尿量，为M ml；将收集到的小鼠尿液以4000rpm离心5 min，取1 ml上清液待测；根据CBB尿蛋白定量测试盒(购自南京建成生物工程研究所)测定蛋白尿浓度：自小鼠24 h尿蛋白A(mg/24 h)=尿蛋白浓度(mg/L)×M/103。

1.6 血清抗体和生化指标的检测

小鼠空腹12 h后麻醉，摘取眼球取血于EDTA抗凝管中,3000 r/min离心15 min，吸取上层血浆装于1 ml EP管中,-80 ℃冰箱保存。免疫球蛋白IgG及补体C3检测通过免疫透射比浊法。肾功能、血脂检测通过氧化酶法，白蛋白检测通过比色法，所有操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.7 主动脉斑块病理

小鼠自肛门上方自下向上剪开皮肤至咽喉部,依次解剖皮下组织、胸腹膜至暴露胸腹腔脏器。连接输液装置于生理盐水,头皮针穿刺左心室使生理盐水自左心室灌流全身血管,直至主动脉呈透明状。小心游离心脏、主动脉至髂动脉分叉处剪断，主动脉固定于4%多聚甲醛中,4 ℃保存。主动脉组织固定5～7 d后行石蜡包埋切片，HE染色。

显微镜下分别选取主动脉根部切片HE染色的动脉壁，实验结果经数码相机采集，Image Pro Plus6.0图像分析软件测量计算主动脉根部每一切面横截面AS改变的面积和管壁面积及其比值，取其平均值后进行统计分析。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 各处理组对肝肾功能与血脂的影响

表1示，与正常对照组比较，模型组尿素氮、肌酐、胆固醇和甘油三酯水平明显升高(P<0.01)。与模型组比较，西药治疗组和中药治疗组尿素氮和肌酐水平较均明显下降(P<0.05或P<0.01)。与模型组和西药治疗组比较，中药治疗组胆固醇和甘油三酯水平均明显下降(P<0.05或P<0.01)。

表1 各组肝肾功能和血脂比较

2.2 各处理组对免疫状态和蛋白尿的影响

表2示，与正常对照组比较，模型组免疫球蛋白IgG水平明显升高，补体C3水平明显下降，脾脏质量和蛋白尿增加(P<0.01)。与模型组和西药治疗组比较，中药治疗组IgG水平均明显下降(P<0.01)，3组之间C3水平比较差异无统计学意义。与模型组比较，西药治疗组和中药治疗组脾脏质量和蛋白尿水平均明显下降(P<0.01)。

表2 各组免疫指标、蛋白尿和动脉斑块比较

2.3 各处理组主动脉斑块评估

各组小鼠主动脉斑块组织病理变化：正常对照组主动脉罕见动脉斑块；模型组主动脉壁黏膜层粥样斑块形成，斑块内见大量胆固醇结晶，部分见钙盐沉积，大量泡沫细胞和少量淋巴细胞，管腔高度狭窄；西药治疗组病变较模型组稍减轻，主动脉壁黏膜层粥样斑块形成，斑块内见大量胆固醇结晶，少量泡沫细胞和淋巴细胞，管腔中到重度狭窄；中药治疗组病变较模型组和西药治疗组明显减轻，可见主动脉壁黏膜层局部薄层粥样斑块形成，斑块内见胆固醇结晶，增生的纤维组织，少量泡沫细胞和淋巴细胞，官腔轻度狭窄(图1)。

图1 各组小鼠主动脉斑块HE染色

与正常对照组比较，模型组动脉斑块面积明显增大(P<0.01)。中药治疗组斑块面积较西药治疗组和模型组均明显下降(P<0.01)，西药治疗组较模型组也有下降(P<0.05)(表2)。

3 讨论

系统性红斑狼疮是一种累及多系统多器官的自身免疫性结缔组织病，临床表现复杂多样，其本质是由自身免疫介导的炎症反应，本病好发于中青年女性。近年来，随着对SLE发病机制的深入研究与诊疗水平的不断提高，SLE患者的预后获得了显著改善，生存期得以延长，但随着病程的延长，患者的重要脏器损害表现越来越明显。早发动脉粥样硬化就是其中的一种常见并发症，可导致心血管疾病的高发病率和死亡率[1-3]。

中医学无狼疮病名记载，但根据其活动期特征样皮疹、关节炎、发热、高血压、蛋白尿、水肿等主要症状表现，属于“水肿” “红蝴蝶疮” “肾着” “阴阳毒” “虚劳”等范畴。《灵枢·百病始生》曰：“风雨寒热，不得虚，邪不能独伤人。卒然逢疾风暴雨而不病者，盖无虚，故邪不能独伤人。”正气不足，卫外不固，毒邪乘机侵入，毒邪内蕴于脏腑经络使血脉凝滞，瘀阻脉络。瘀血作为病理产物，使水液运行输布障碍，湿浊内停，湿瘀蕴结于肾络，肾络受损失于封藏。故狼疮的发生以脏腑虚损为内在基础，毒邪侵袭为重要条件，而瘀血则贯穿于疾病全过程。 动脉粥样硬化发病机制为痰瘀凝结于脉道，其本在于肾虚。《景岳全书·虚损》云：“肾水亏，则水不归源而脾痰起。”肾不化水，水湿停聚日久成痰，脏腑亏虚日久生瘀， 痰瘀二者互相影响，痰能致瘀，瘀能生痰，痰瘀搏结于脉道使血流不畅，导致本病发生。因此，“肾虚为本，血瘀为标”是狼疮和动脉粥样硬化共同的中医病机。

本研究采用制首乌、蒲黄作为药对治疗。首乌为补肾之要药，《本草经解》：“何首乌味苦涩无毒，得地火水之味，入手少阴心经、足少阴肾经……心血充则肾精足，其坚筋骨益精髓者，气温益胆，味苦涩而交心肾也。[4]”蒲黄善消瘀血，《本草正义》：“蒲黄，专入血分， 以清香之气，兼行气分，故能导瘀结而治气血凝滞之痛。[5]”二药合用补中寓泻、动静相宜，共奏补肾活血之法。现代药理研究显示，首乌中含有的卵磷脂、蒽醌衍生物及大黄酚等多种物质，可以有效抑制胆固醇浓度，减少胆固醇被肠道黏膜吸收，增强高密度脂蛋白作用，防止血清中脂质产物滞留，可以有效抗动脉粥样硬化形成[6-7]。蒲黄能够抗血小板聚集，其中总黄酮的作用最强[8]，其抗血小板聚集作用可能与抑制磷酸二酯酶活性有关[9]。蒲黄水提液还能不依赖纤溶酶系统存在，直接分解纤维蛋白，促纤维蛋白溶解。更有研究显示[10]，蒲黄中不饱和脂肪酸及槲皮素均可降低血脂并防治粥样硬化。

ApoE-/-小鼠是目前用来研究动脉粥样硬化非常经典的动物模型[11]。载脂蛋白的作用是转运一些脂蛋白，因此当载脂蛋白缺乏的时候体内容易出现胆固醇等物质堆积，从而形成动脉粥样硬化。Pristane是从矿物油中提取的一种有机烷类物质，是目前常用的药物诱导型狼疮模型的诱导剂。Satoh M等1995年发现，给非自发性免疫鼠BALB/c鼠一次性腹腔注射Pristane 0.5 ml可成功诱导小鼠狼疮[12]，之后陆续发现非自身免疫性小鼠对Pristane的易感性普遍存在，其中包括C57BL/6小鼠[13]。该造模方法小鼠外周血循环产生大量的ANA抗体、anti-dsDNA抗体、抗snRNP/Sm抗体、anti-Su抗体等，同时可导致肾小球肾炎、蛋白尿、关节炎等病变，与人类系统性红斑狼疮具有相似的血清特异性抗体和肾脏免疫复合物沉积，有较好的相关性[14]。

近年来，通过用动脉粥样硬化模型鼠诱导狼疮模型的研究逐渐增多。Zhang CY等[15]对 ApoE-/-小鼠进行腹腔注射Pristane，ApoE-/-pristane组小鼠出现ANA、ENA水平的升高和脾肿大，其中包括抗Sm、抗nRNP、抗核糖体抗体，符合SLE 的特征。本研究采用相同的方法造模，该造模方法对动物及实验条件的要求相对较低，腹腔注射一次性完成，动物死亡率低，同时该模型在临床表现、免疫学、组织病理学等多方面接近人类SLE合并动脉粥样硬化的疾病表现，是目前较理想的方法。

研究结果表明，中药治疗组免疫球蛋白IgG水平较西药治疗组和模型组均明显下降，中药治疗组和西药治疗组脾肿大程度较模型组均明显改善，但2组之间比较差异无统计学意义。西药治疗组和中药治疗组尿素氮、血肌酐以及蛋白尿水平较模型组均明显下降，但2组之间比较差异无统计学意义。中药治疗组血脂水平较西药治疗组和模型组均明显下降。与西药治疗组和模型组比较，中药治疗组主动脉内膜及中膜厚度有较大减低，泡沫细胞减少，主动脉粥样硬化斑块面积明显减少，管腔狭窄减轻。本研究提示，中药治疗组在降血脂和改善动脉斑块方面的作用与现代药理学研究首乌和蒲黄的降血脂、抗动脉粥样硬化作用相吻合。而西药治疗组使用药物吗替麦考酚酯为次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶抑制剂，其主要的作用机制在于抑制嘌呤从头合成，从而抑制淋巴细胞活化，是目前治疗狼疮肾炎的首选药物之一[16]。因而其对于肾脏病变的缓解作用更明显，对于动脉粥样硬化的改善较微弱。首乌和蒲黄同时具有的抗凝与促纤维蛋白溶解作用，可能与其降低肾功能和改善肾脏损伤密切相关。免疫球蛋白IgG和补体C3是反映系统性红斑狼疮病情活动的指标，研究结果显示中药治疗组仅仅在IgG方面较前改善，西药治疗组IgG和C3水平治疗前后比较均无改善，可能与本动物实验所使用的药物及其剂量疗程尚不足相关。

综上所述，补肾活血中药可明显改善SLE合并动脉粥样硬化模型鼠的高免疫球蛋白血症，减轻脾肿大，改善肾脏病变，调节血脂代谢水平，减轻主动脉粥样硬化病理程度。 补肾活血法的降血脂作用、改善免疫球蛋白水平和动脉斑块方面作用比西药治疗更明显。本课题组将进一步深入了解动脉粥样硬化的病理过程与免疫反应的关系，探讨补肾活血法的作用机制，以期为临床控制SLE早发动脉粥样硬化、预防SLE心血管事件提供新思路、新方法。