训练犬检测肺癌的影响因素研究

2021-03-31赵勤涛熊玉强毛嘉禾张建华

中国工作犬业 2021年3期

赵勤涛熊玉强芦帅于毅毛嘉禾张建华葛峥

为了检验吸烟人群的呼出气体、医院环境气味和训练方法对嗅癌犬训练的影响，本研究以肺腺癌为试验对象，以患者的呼出气体为嗅源，选择3头2岁的马里努阿犬作为训练用犬，采集了36例肺腺癌患者的样本和108例含有不同干扰气味的健康人群样本，分5组分别测试了在无干扰气味、吸烟气味和医院环境气味条件下犬对肺癌气味反应的特异度和灵敏度，同时测试了在无阳性样本的情况下，犬的示警反应情况，以及对吸烟气味和医院环境气味的反应。结果表明，在没有吸烟气味和特定环境气味干扰的情况下，3头犬对肺腺癌气味检测的平均灵敏度和特异度达到了97.2%和99.6%，在吸烟和医院环境气味条件下，检测的灵敏度和特异度分别83.3%和97.6%、88.9%和98.4%，A、B、C3组之间差异不显著，但在空白测试条件下，犬更倾向于对吸烟气味和医院环境气味反应。说明犬能识别肺腺癌患者呼出的气味，吸烟气味、医院环境气味和否定式的训练方法对嗅癌犬的训练有影响。

一、嗅癌犬的研究背景

近年来，越来越多的试验证据表明经过训练的犬可以通过嗅闻癌症患者的血液、呼出气体或体液气味来识别癌症，并表现出了较高的灵敏度和特异度。使用载体吸附气味对宫颈癌的研究显示，犬可以准确识别子宫颈细胞涂片样本和吸附材料样本中的癌症气味，总体检测的成功率达到90%以上，使用尿液样本区分前列腺癌的灵敏度和特异度均达到91%，使用呼出气体样本区分直肠癌的灵敏度和特异度达到了91%和99%，显著高于常规肠镜检测的灵敏度。Horvath等人以不同部位的癌症样本（卵巢、子宫颈、子宫体及会阴部）和健康人群的样本为试验材料，采用双盲法用一头经过训练的犬对卵巢癌样本进行识别，结果显示，犬对卵巢癌样本的灵敏度和特异度分别达到了100%和97.5%，并且该研究暗示不同部位的癌症有着不同的特殊气味。使用气相色谱和质谱(GC/MS)对癌症患者呼出气体的挥发性有机物（VOCs）标记筛查的研究也证实不同的癌症之间有特异度的VOCs。在犬识别肺癌上的研究同样取得了积极效果，有研究使用分别来源于113个不同人的390个样本进行检测，犬检测的灵敏度和特异度分别达到了95%和98%，使用血液样本对肺癌的研究也显示犬识别的灵敏度和特异度达到了96.7%和97.5%。但是在不同的研究结果之间表现出了较大的差异，Hackner等人采用随机样本测试的方法对122个肺癌病人的样本进行检测发现，其阳性预测值和阴性预测值分别是30.9%和84%，Ehmann等人对肺癌的研究也发现，其总体灵敏度和特异度只有71%和93%，这些数据远低于其他对肺癌研究的结果。同样的情况也发生在了对其他癌症的研究上。这说明利用犬的嗅觉进行癌症气味的特异度识别还存在着诸多干扰因素，比如吸烟、饮食情况、医院环境下特有的气味等干扰气味，以及犬种、训练方法、不同的统计方法等方面是否会对检测结果产生影响，目前尚未有研究对这些问题进行测试。

为了研究影响嗅癌犬训练和检测结果的因素，本文以肺腺癌患者为研究对象，以患者呼出的气味为检测样本，选择公安部南昌警犬基地3头2岁的搜爆犬作为训练用犬，研究吸烟气味、医院环境气味和训练方法因素对嗅癌犬训练和对肺癌气味识别的影响，为嗅癌犬的训练和研究提供参考。

二、材料和方法

（一）试验材料

1.试验用犬

本研究从公安部南昌警犬基地选择3头2岁的马里努阿犬作为训练用犬，分别编号为1号犬、2号犬和3号犬。其中公犬2头（1号和3号），母犬1头（2号），1号和2号犬曾进行过3个月的搜爆训练，3号犬进行过3个月的搜毒训练。

2.试验对象

以肺腺癌患者为研究对象，以纱布吸附的人呼出气体作为犬的嗅源。本试验共采集36例肺腺癌患者样本，36例不吸烟的但含有医院特定环境气味的健康人群样本，36例不吸烟也不含医院环境气味的健康人群样本和36例吸烟但不含医院特定环境气味健康人群样本，每例样本采集3份，共采集144个不同人的432份样本。因为30岁以下恶性肿瘤的发病率相对较低，本试验所采集的健康对照样本均是30周岁以下的青年人样本。具体采样信息见表1。

3.样本采集方法

将3层纱布块放入口罩中，把纱布对准口鼻腔戴上口罩5分钟，5分钟后取出纱布放入采集瓶中，盖紧瓶盖，然后用封口膜封住瓶盖缝隙，将样品放入-20℃的冰箱中冻存（见图1）。采集样本使用的采集瓶由义乌市龙川玻璃制品有限公司生产；吸附呼出气体气味所使用的纱布（规格7.5×7.5cm）由绍兴振德医用敷料有限公司生产；比克曼生物提供的无菌采样袋；口罩使用的是江西国康实业有限公司生产的单个装医用无菌外科口罩。

（二）试验方法

1.犬的训练方法

利用犬的食物动力、捕猎动力和探求反射，采用操作式条件反射和正强化的方法对3头犬进行训练，历时7周，每周训练7～12次，训练过程中所使用的对照组样本均是不吸烟、不含医院环境气味的健康人的饭前样本，训练形式见图2。

第1周训练犬对肺癌气味的兴奋性反应，使用8个鉴别罐，其中7个罐子是空的，1个罐子里放入目标物气味，当犬重嗅目标物后对其进行食物奖励。

第2周训练犬对纱布气味的干扰，使用8个鉴别罐，其中7个罐子里放无人体气味的纱布，1个罐子里放入目标气味，让其从8个罐子里找到目标物气味并“坐下”示警，然后给予食物奖励。

第3～4周训练犬从不同的人体气味中识别目标气味，使用8个鉴别罐，其中7个罐子里放入含有不同人的呼出气味的纱布作为对照组，1个罐子里放入目标气味，另外使用1个鉴别罐放入和目标物气味相同的气味作为嗅源，先让犬闻嗅源，给予食物奖励，然后再让其从8个鉴别罐中找出与嗅源相同的目标气味。

第5周训练犬从不同的目标气味中找到共性的气味。训练方式同上，但使用的嗅源气味与目标气味是来源于不同的肺腺癌患者，对犬进行分化训练。

第6～7周的训练去掉嗅源，直接让犬进行搜索。使用8个鉴别罐，随机放置7个对照样本和1目标样本，强化犬对肺癌气味的联系。

图2 犬的训练方法

2.试验测试方法

本试验的测试共分为5组，测试所使用的样本均是未使用过的新采集的样本。所有的测试都采用“双盲法”进行。

A组:使用12个肺癌气味样本和36个无特定气味样本。

B组:使用12个肺癌气味样本和36个吸烟但不含医院环境气味的样本。

C组:使用12个肺癌气味样本和36个不吸烟但含医院环境气味的样本。

A、B、C组测试的目的是测试3头犬在无特定气味和吸烟气味、医院环境气味干扰的条件下犬对肺腺癌检测的灵敏度和特异度，测试医院环境气味和吸烟气味对嗅癌犬训练的影响；按照上述犬的训练方法，每组放8个鉴别罐，其中1个是目标气味，7个是对照样本，每组每头犬分别测试12次。

为了进一步测试两种干扰气味和空白训练对嗅癌犬的训练的具体影响，本文设计了D、E两组测试，以吸烟气味或含有医院环境气味的健康样本作为目标物，无特定气味的样本作为对照，每组分为6次测试，每次测试有7个对照样本和1个目标样本组成。

D组:使用6个吸烟但不含医院环境气味的样本和36个无特定气味样本。

E组:使用6个不吸烟但含医院环境气味的样本和36个无特定气味样本。

（三）数据处理方法

为了评估犬的嗅觉检测肺癌气味的能力，使用Excel程序文件计算了检测的灵敏度和特异度。同时，为了确定3头犬在不同条件下对肺癌检测结果的统计学差异，采用独立样本t检验计算统计学显著性(P-value)。

灵敏度=检测阳性数/（检测阳性数+假阴性数）×100%；

特异度=检测阴性数/（检测阴性数+假阳性数）×100%。

三、结果

由表2和表3的结果显示，A组犬检测肺癌阳性的表现最好，灵敏度和特异度平均值分别达到了97.2%和99.6%，C组次之，分别达到88.9%和98.4% ，B组分别达到83.3%和97.6%，总和灵敏度达到89.8%，特异度达到98.5%。差异性显著性分析显示，A、B、C三组之间检测的平均特异度和灵敏度差异不显著。同时从表2结果可以看出，三组测试中犬检测的灵敏度和特异度均高于概率值，说明犬有能力识别肺癌气味。

表2 3头犬在不同条件下的检测结果

通过D组和E组的试验发现，在空白测试的情况下犬会产生示警反应，在两种气味干扰的情况下，犬示警的次数分别为11次和9次，示警的比例分别是61.1%和50%。犬对吸烟气味和医院环境气味示警反应总次数分别为9次和8次，示警反应的比率分别为50%和44.4%，均高于概率值。同时，吸烟气味和医院环境气味示警的次数占总示警次数的比率分别为81.8%和88.9%。这一结果说明吸烟气味和医院环境气味对嗅癌犬的训练会产生影响。同时结果暗示进行空白训练的必要性。

表3 空白测试条件下犬的示警反应情况

四、讨论

（一）经过训练的犬可以通过特异度识别肺腺癌气味

近年来，越来越多的试验证据表明经过训练的犬可以通过嗅闻癌症患者的血液、呼出气体或体液气味来识别癌症，并取得了积极效果。Rudnicka等人使用呼出气体作为嗅源对肺癌的研究发现，犬对肺癌患者气味识别的灵敏度和特异度分别为86%和72%，高于使用色谱法（GC-MS）检测的灵敏度和特异度。本研究使用36个不同患者的呼出气体样本，经过108次测试，结果显示犬对肺腺癌检测的灵敏度和特异度分别为89.8%和98.5%，说明肺腺癌患者的呼出气体中含有独特的气味，经过训练的犬可以特异度识别这种肺腺癌气味。这一结论得到了来自GC-MS对呼出气体分析的支持，对呼出气体标记物的研究认为不同的癌症有着不同的代谢物，肺癌患者的癌细胞代谢出的挥发性有机物（VOCs）使呼出气体有着独特的气味，Phillips博士等人根据呼出气体成分在色谱仪上峰值分布区域所占的比例不同，发现22种VOCs在肺癌和非肺癌之间存在差别，即使在I期肺癌也有较高的灵敏性和特异度，分别为66.7%和100%。Wang使用23种VOCs标记物从对照组中区分肺癌患者的灵敏度和特异度是96.5%和97.5%，这充分说明肺癌的代谢有其独特的气味。

（二）吸烟气味和医院环境气味对犬检测肺癌准确性的影响

影响嗅癌犬训练的干扰气味因素很多，其中吸烟气味和医院环境气味被认为是最重要的两个因素。有研究通过对比混杂吸烟气味后犬检测癌症的灵敏度和特异度发现，吸烟气味对犬检测的灵敏度和特异度没有显著影响。而本研究通过对比在无干扰气味和另外两种干扰气味存在的条件下犬嗅诊肺癌的准确性发现，虽然在干扰气味存在的条件，犬检测的灵敏度没有显著差异，但是在空白测试过程中，犬更倾向于对吸烟气味和医院环境气味两种干扰气味产生示警反应，说明这两种气味对嗅癌犬的训练有负面影响，这一结果与Walczak的研究结果一致。产生这种差异可能是因为肺癌患者中吸烟的优势比高于不吸烟人群，在嗅癌犬的训练过程中，吸烟气味获得了更多的正强化机会。

由于犬训练过程中使用的目标气味样本大多来自肿瘤医院的癌症确诊患者，因此医院环境中所特有的消毒液和医药的气味被认为是一种潜在的干扰气味。有研究表明，在医院外面采集患者的呼出气体可以显著降低犬示警的优势比，在医院外采集样本犬检测的准确性更高，而在医院内采集样本时犬更容易出现假示警。本研究通过对比犬在无气味干扰和在医院气味干扰条件下犬检测的准确性发现，医院气味对犬检测的灵敏度和特异度虽然没有显著影响，但表3的结果暗示，犬可能将医院环境气味和肺癌气味作为一个整体的混合气味进行记忆，从而使医院气味对训练过程产生干扰。因此在嗅癌犬的训练过程中，需要采取必要措施防范医院环境气味对犬的干扰。

（三）训练方法对检测结果的影响

不同的训练方法可能对犬检测肺癌的灵敏度和特异度有显著影响。通过表2可以看出，吸烟气味对犬检测肺癌的灵敏度和特异度没有显著影响，但表3的结果表明，在没有目标物存在的情况下，犬可能会对熟悉的气味产生反应，甚至对医院环境气味反应的灵敏度达到了100%。这一结果暗示否定式训练在嗅癌犬训练过程中的必要性，即在一组测试中没有目标气味样本，犬不能对其中任何一个样本反应。一次训练中必有1个目标气味样本的“强迫示警”的训练方法，会造成检测结果的灵敏度高于正常值，以及假阳性率的升高。因为在正常的肺癌检测过程中，即使是对经过其他医学方法检测过的可疑样本进行复检，癌症患者的比例依然很低，甚至在一组检测中没有癌症样本，而“强迫示警”的方法会使犬在找不到目标物的情况下对其他样本产生示警反应，导致假阳性率的升高，这一结果与Hackner等人对肺癌的研究结果一致。除此之外，样本呈线性设计的训练方法同样会对检测结果产生影响。在一次训练中，犬对样本的反应会呈现以下几种状态：对目标样本的正确指示、对对照样本的假示警以及对不确定样本的犹豫状态。当一组线性排列的8个样本中，如果是随机阳性样本（阳性样本数0～8个）设计，犬对每个样本产生示警反应的概率均为50%，若是确定只有1个阳性样本，犬对阳性样本示警的概率则为20%。在“强迫示警”的条件下，呈线性排列的一组样本，随着犬逐步排除对照样本，犬对后面的样本反应的概率逐步提高，造成假示警的概率升高。