3 种产量水平下酿酒甜葡萄果实品质的差异

乐小凤，曹建宏，赵亚蒙，尹春晓，鞠延仑，张振文,3,*

（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.香格里拉酒业股份有限公司，云南 迪庆 674400；3.陕西省葡萄与葡萄酒工程中心，陕西 杨凌 712100）

刺葡萄（Vitis davidiiFoex.）是葡萄科葡萄属东亚种群的一种野生种质资源，原产于湖南、云南、广东、江西、浙江等省，是多年生落叶藤本植物[1]。刺葡萄作为湖南特色的种质资源之一，具有优良的品种特性，湖南省怀化市中方县的刺葡萄也开始从鲜食往酿酒的方向发展[2]。

葡萄果实中的酚类物质对葡萄酒颜色、口感、酒体和结构起着重要的作用，酚类物质的生物合成与积累主要受葡萄品种、土壤条件、气候、产地、栽培方式[3-9]等因素的影响。产量的调控是影响酿酒葡萄果实与葡萄酒质量的一项重要的栽培措施[10-13]，可通过疏花、疏果和冬剪等措施实现。葡萄新梢上结果过多，葡萄果实糖分和酚类物质积累缓慢，养分的消耗过度易造成葡萄树体的早衰，从而导致葡萄果粒不能正常生长和着色困难；葡萄新梢上结果过少，影响葡萄植株生殖生长与营养生长的平衡。每个葡萄品种的适宜产量不一，豆一玲等[14]对欧亚种酿酒葡萄霞多丽进行不同负载量的实验，结果显示，在一定范围内降低葡萄负载量能提高浆果和葡萄酒品质，产量过大则品质表现较差；宋润刚等[15]研究结果表明随着山葡萄产量的增加，果穗质量、果粒质量和果实总糖含量大幅度降低；陈奕霖等[16]以山东烟台地区欧亚种酿酒葡萄蛇龙珠为实验材料，研究不同产量水平对浆果品质的影响，结果显示，随着产量的降低，果实的成熟期呈明显缩短的趋势，葡萄果皮的总酚和总花色素含量呈上升趋势，且在一定的产量范围内，产量降低，单宁含量上升。目前，有关产量对酿酒葡萄果实品质影响的报道较多[17-19]，对刺葡萄品系品质的研究较少，探讨刺葡萄的主要酚类物质对刺葡萄酒酿造有着重要的作用。本实验以刺葡萄品系中的甜葡萄品种为试材，研究不同产量对甜葡萄果实品质及酚类物质的影响，以期为湖南省刺葡萄酒的生产酿造提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验地位于湖南省怀化市中方县桐木镇，供试材料为刺葡萄品系中的甜葡萄品种，定植于2008年，棚架，株行距为3.5 m×5.5 m，常规管理。

甲酸、甲醇、盐酸和乙腈均为分析级，所有花色苷单体标准样和单体酚单体标准样均为色谱纯，购自美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪、UV-1700紫外-可见分光光度计美国Agilent公司；5804R低温冷冻离心机 德国Eppendorf公司；KH200KDB超声波振荡器 昆山禾创超声仪器有限公司；CentriVap 78100-40离心浓缩系统美国Labconco公司；FA2004型电子天平 上海精科实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 产量管理和采样

2014年和2015年，当甜葡萄果粒发育到黄豆粒大小时，即花后两周时进行疏穗处理，高产为原有最高产量，每个结果枝果穗处理成平均2 穗，产量预测2 500 kg/667 m2（L3）；中产将每个结果枝果穗处理成平均1.5 穗，产量预测1 900 kg/667 m2（L2）；低产处理为将所有果枝均留1 穗，产量预测1 300 kg/667 m2（L1）。每个处理随机选长势一致的20 株葡萄植株，均重复3 次。葡萄成熟时（还原糖质量浓度＞170 g/L），每个处理随机采600 粒果实，3 次生物学重复。随机取200 粒果实用于测定还原糖和总酸含量，剩余葡萄样品存储于-40 ℃冰箱，用于花色苷和单体酚的测定。

1.3.2 果实基本指标的测定

采用斐林试剂热滴定法测定还原糖含量[20]；酸碱滴定法测定总酸含量[21]。

1.3.3 果皮花色苷测定

每个处理随机取200 粒果实，冷冻且避光状态下剥皮，液氮速冻后打粉并置于冷冻干燥机中烘干，随机称取0.5 g干粉，用10 mL甲酸-甲醇溶液（2%）溶解，避光超声10 min后25 ℃摇床振荡提取30 min，4 ℃、8 000 r/min离心5 min，取上清液，以上提取步骤重复4 次，合并上清液于旋转蒸发仪31 ℃蒸干，残渣用流动相溶解并定容至10 mL，-80 ℃保存备用，样品进样前用0.45 μm有机滤膜过滤，使用高效液相色谱-三重四极杆-离子阱串联质谱仪检测，分析条件参照文献[22]。

1.3.4 果皮非花色苷单体酚类物质测定

干粉制备过程与花色苷一致，非花色苷单体酚类物质则称取1.0 g干粉、添加5 mL蒸馏水和45 mL乙酸乙酯，25 ℃、150 r/min摇床中避光提取30 min，收集上清液，再重复提取3 次，合并上清液后于旋转蒸发仪（30 ℃）蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2 mL，-40 ℃保存备用，样品进样前用0.45 μm有机滤膜过滤，使用高效液相色谱-三重四极杆-离子阱串联质谱仪检测，分析条件参照文献[22]。

1.4 数据处理

采用SPSS软件进行数据处理，进行Duncan检验，P＜0.05，差异显著。用Excel软件制作图表。

2 结果与分析

2.1 产量对甜葡萄果实总酸和还原糖含量的影响

如图1所示，2014年和2015年甜葡萄总酸含量随产量增大而增加，L3产量葡萄的总酸显著高于其他2 个处理，其中L1的葡萄总酸含量最低；甜葡萄的还原糖含量则随产量增大而降低，2014年和2015年的甜葡萄L1的还原糖质量浓度分别为193.87 g/L和187.66 g/L，与L3相比，分别提升了6.00%、6.90%。

表 1 产量对甜葡萄单体花色苷和含量的影响Table 1 Effect of different crop yields on anthocyanin composition and content of Tianputao berries

图 1 不同产量的甜葡萄总酸（A）和还原糖（B）含量Fig. 1 Total acid (A) and reducing sugar (B) contents of Tianputao berries with different loading treatments

2.2 产量对甜葡萄果实单体花色苷含量的影响

如表1所示，各样品均检测到9 种花色苷，包括4 种基本花色苷，1 种咖啡酰化花色苷，4 种香豆酰化花色苷。4 种基本花色苷包括花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、甲基花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、二甲花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷。2014年，除花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷之外，其他3 种基本花色苷含量均随着负载量的增加而显著降低；2015年，除二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和甲基花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷含量表现为随负载量的增加而降低外，其他基本花色苷含量均为L2处理最高。2015年，甜葡萄果皮的咖啡酰化花色苷含量为L1处理最低，咖啡酰化花色苷约占单体花色苷总量的2.00%。在酰化花色苷中，二甲花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷含量占比最大，表现为L1处理含量略低。由表1可知，年份对花色苷总量影响较大，2014年表现为L1含量最高，2015年则为L2含量较高；其中基本花色苷总量均表现为L3处理的葡萄含量最低。

2.3 产量对甜葡萄果实非花色苷单体酚类物质含量的影响

表 2 不同产量的甜葡萄非花色苷单体酚类含量Table 2 Effect of different crop yields on non-anthocyanin monomeric phenolic compounds contents of Tianputao berries

如表2所示，其中羟基苯甲酸和羟基肉桂酸类物质占非花色苷单体酚类物质总量的比例小，黄酮醇类物质占比高达99%。从两年的非花色苷单体酚类物质总量和黄酮醇类物质含量看，L2处理的葡萄含量最高，其次是L1处理，L3产量的葡萄含量最低。2014年，L1、L2和L3处理的葡萄中分别检测到13、11 种和12 种非花色苷单体酚类组分，山柰酚-3-O-葡萄糖苷和3-羟基肉桂酸只在L1处理的葡萄中检测到，二氢山柰酚只在L3处理的葡萄中检测到；除了原儿茶酸和香草酸在L1处理中含量最高，其他非花色苷单体酚类组分含量均表现为L2处理的葡萄显著高于另外2 个处理，其中槲皮素-3-O-半乳糖苷、鼠李糖素-3-O-半乳糖苷和丁香亭-3-O-葡萄糖苷的含量在L1和L3之间差异不显著。2015年，L1处理的葡萄中未检测到3-羟基肉桂酸，除阿魏酸和二氢山柰酚外，其他非花色苷单体酚类含量均表现为L2＞L1＞L3，且差异显著。2014年的非花色苷单体酚类组分含量略高于2015年，这可能是由于年份之间的差异造成的。

2.4 不同产量甜葡萄果实的主成分分析（principal component analysis，PCA）

图 2 不同产量甜葡萄品质的第1、2主成分得分散点图Fig. 2 Scatter plot of the first two principal components for quality attributes of Tianputao berries with different crop yields

运用SPSS软件对两年不同产量甜葡萄的还原糖、总酸、单体花色苷以及非花色苷单体酚类含量分别进行PCA，并分别以前两主成分作散点图。由图2可以看出，两年间3 种产量下的甜葡萄分布范围较为一致，分布较分散说明3 种产量下的甜葡萄品质具有差异性。2014年，PC1贡献率为59.126%，主要反映了还原糖、总酸和大部分单体花色苷以及非花色苷单体酚类的变异信息；PC2贡献率为39.513%，反映了部分非花色苷单体酚类的变异信息。影响L1处理葡萄的成分主要分布在PC1的正方向和PC2的负方向，L1产量下果实的还原糖、甲基花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、二甲花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、花翠素香豆酰化葡萄糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、原儿茶酸、香草酸和3-羟基肉桂酸含量更高。影响L2处理葡萄的成分主要分布在PC1和PC2的正方向，L2产量下果实的花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、鼠李糖素-3-O-半乳糖苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸酐、槲皮素-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷含量更高。影响L3处理葡萄的成分主要分布在PC1和PC2的负方向，L3产量下果实的总酸、花翠素咖啡酰化葡萄糖苷、二甲花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷和二氢山柰酚含量较高。2015年，PC1贡献率为67.857%，主要反映了部分单体花色苷以及非花色苷单体酚类的变异信息；PC2贡献率为26.329%，反映了总酸、花翠素咖啡酰化葡萄糖苷、二甲花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷、阿魏酸、3-羟基肉桂酸和二氢山柰酚的变异信息。3 种产量下的甜葡萄分布与2014年较为一致，L1产量下果实的还原糖、甲基花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷含量较高；L2产量下果实的花翠素香豆酰化葡萄糖苷、甲基花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷、原儿茶酸、香草酸、鼠李糖素-3-O-半乳糖苷、鼠李糖素3-O-葡萄糖苷和丁香亭-3-O-葡萄糖苷的含量更高；L3产量下果实的总酸和二氢山柰酚含量较高。

3 讨论与结论

本实验通过不同产量对甜葡萄果实还原糖、总酸、单体花色苷和非花色苷单体酚类的影响进行研究，结果表明，相比于2 500 kg/667 m2的产量，1 300 kg/667 m2和1 900 kg/667 m2的产量显著提高了果实的还原糖含量，并降低了总酸含量，这与前人研究结果一致[23]。较低产量促进了果实成熟过程中呼吸作用对酸的消耗，从而降低了葡萄总酸的含量[24]。较高的还原糖含量可以有效提高酒的乙醇体积分数，从而增加酒的醇厚感；葡萄总酸含量降低能适当的减弱高酸度给葡萄酒带来的刺激感，使葡萄酒更加平衡[12]。花色苷类物质是葡萄果实和葡萄酒的主要呈色物质，在很大程度上决定着葡萄果实和葡萄酒的品质，由花色素作为糖苷配基或乙酰化的糖苷配基和糖结合生成，其修饰方式与甲基化和羟基化程度有关，甲基化则能加深葡萄酒的红色色调，羟基化使葡萄酒往蓝色色调转变[25-26]。葡萄中的花色苷通常会在C6位与香豆酸、咖啡酸、乙酸发生酰化反应，从而有助于颜色的稳定性[12]。花色苷在葡萄中是由类黄酮代谢途径合成，主要由苯丙氨酸裂解酶、肉桂酸羟化酶、查尔酮合成酶、查尔酮异构酶、黄烷酮-3-羟化酶、二氢黄酮醇还原酶、无色花色素双加氧酶、甲基转移酶和谷胱甘肽转移酶等相互作用合成的[27]，也受到MYB等相关转录因子的控制[19]。在葡萄中，花色苷的生物合成和积累主要受遗传因素影响[28]，同时也受激素[29]和果实成熟度[30]等内部影响，环境因素[31-32]（温度和光照）和田间栽培措施[9,33]（调亏灌溉、干旱、摘叶、避雨）也决定着花色苷的生物合成与积累。本实验中，3 种产量下的刺葡萄果皮均检测到9 种花色苷，低产量显著提高了花色苷总量，这与King等[34]研究结果一致。相关研究也表明合理降低产量可以提高红色葡萄浆果的花色苷含量，改善葡萄品质，也可以显著改善葡萄酒的感官品质、结构感和收敛性[35-38]。疏穗处理可能改善了植株的库源关系以及浆果的微环境，从而有利于花色苷的合成和积累[39]。非花色苷单体酚类是葡萄中重要的生物活性物质，主要包括羟基肉桂酸、羟基苯甲酸、黄酮醇、黄烷醇和芪类等[40]。黄酮醇类对酒的涩感也有一定影响，是葡萄酒的重要保健成分[41]，本研究中黄酮醇类物质占非花色苷单体酚类比例高达99%以上，两年结果表明，1 900 kg/667 m2产量下的葡萄非花色苷单体酚类总量和黄烷醇类物质含量最高，2 500 kg/667 m2产量下最低，说明适量的疏穗可以有效提升葡萄非花色苷单体酚类物质的含量，这与刘迪迪等[12]研究结果一致。Haselgrove等[42]认为黄烷醇和黄酮醇等次生代谢物的浓度在一定程度上依赖于植株的产量。1 300 kg/667 m2产量下不利于葡萄黄酮醇的合成与积累，这可能是因为疏果较多时导致葡萄植株营养生长过剩，消耗养分的同时还易造成叶幕郁闭，从而不利于相关代谢物的合成与积累[43-45]。

本实验通过对湖南省中方县3 种产量模式下甜葡萄果实品质和酚类物质组成的分析发现，与2 500 kg/667 m2产量相比，1 900 kg/667 m2甜葡萄中花色苷组分和非花色苷单体酚类物质含量显著提高，适当的减少产量可以为酿造优质刺葡萄酒提供理论依据。