基于UPLC-QTOF-MS代谢组学技术的NFC和FC橙汁差异成分比较

刘晗璐，张九凯，韩建勋，孙瑞雪，陈 颖，刘 冰

（1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.食品营养与安全国家重点实验室，教育部食品营养与安全重点实验室，天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457）

果汁是一种广受全世界消费者喜爱的食品。纯果汁不仅能够提供人体所需的多种维生素和矿物质，同时还富含类黄酮和多酚等生物活性物质，具有预防氧化应激和抵抗炎症的作用，有助于防治相关慢性疾病[1-2]。近年来，随着我国经济的持续发展和人民生活水平的不断提高，国内消费者对果汁的消费偏好逐渐从低浓度果汁饮料向中高浓度纯果汁转移[3]。市面上的纯果汁分为非浓缩复原（not from concentrate，NFC）果汁和复原（from concentrate，FC）果汁两类。2015年正式实施的国家标准GB/T 31121—2014《果蔬汁类及其饮料》中明确规定NFC果汁是以水果为原料，采用机械方法制成的可发酵但未发酵的未经浓缩的汁液制品；FC果汁是在浓缩果汁中加入其加工过程中除去的等量水分复原而成的制品。NFC果汁的加工程度较低，且多采用低温贮藏和冷链运输，因此产品的风味和营养价值都更接近新鲜水果，在我国的需求量及消费量正在逐年增长[4]。由于生产和冷链物流成本较高，市面上NFC果汁的零售价格约是FC果汁的2～3 倍，一些商家为牟取巨额利润会使用低成本的FC果汁冒充NFC果汁。

国内外研究者已围绕NFC和FC果汁鉴别展开了研究。δ值是重同位素原子丰度与轻同位素原子丰度比值在样品中的测量值与标样的比值，植物的蒸腾作用使得其组织内部水的D和18O发生富集，而复配浓缩汁时添加的地下水会影响FC果汁中水的δD和δ18O，有研究应用稳定同位素比值质谱法检测NFC和FC果汁，结果发现NFC果汁中水的δD和δ18O明显高于地下水，且区别于FC果汁[5-6]。Lerma等[7]观察到杀菌、浓缩、加水调配等关键商业化加工步骤会显著降低果汁中可鉴定蛋白质数量，同时可能改变果汁的营养特性，在此研究基础上建立了一种评估橙汁以及橙味饮料蛋白质组学特征的分析程序，有助于验证商业产品的真实性。不同于对特定检测指标和大分子物质的分析，Włodarska等[8]基于同步荧光光谱获得了商业NFC和FC苹果汁的代谢指纹图谱，经对比发现两者的荧光光谱存在差异，其中非酶褐变产物的荧光信号是区分FC和NFC果汁的重要原因。此外，Goodner等[9]利用电子鼻识别NFC和FC橙汁的气味组成，然后对所采集数据进行判别因子分析，结果显示2 种橙汁得到充分分离，模型的区分能力良好。

代谢组学是一种旨在识别和量化小分子代谢物的新型研究手段，它从整体角度出发，运用现代检测技术对食品中尽可能多的代谢产物进行分析检测，已在果汁掺假鉴别中得到了广泛应用[10-14]。造成NFC果汁和FC果汁风味和营养成分差异的主要原因一方面在于NFC果汁在原料选用时的严格性，另一方面则在于加工工艺的不同，FC果汁需要经过浓缩，还原复配和二次杀菌的复杂加工，并且NFC果汁在生产时往往采用较温和的杀菌技术[15]。小分子代谢物是食品本身的重要组分，它决定了食品的营养、质地、风味、味道和颜色，这些物质在加工过程中可能发生变化，可以通过代谢组学对它们进行监测和评估[16-18]。

橙汁是世界上消费最广泛的果汁之一，其销量占全球果汁的一半以上。橙汁是最受我国消费者喜爱的纯果汁口味，占比达46.5%[19]。本研究采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）联用技术结合化学计量学方法，对自制NFC和FC橙汁的小分子代谢物进行分析，旨在探明经过不同加工工艺后2 种橙汁间的成分差异，以期为NFC果汁鉴伪研究提供参考，为促进我国果汁饮料行业的稳定发展作出贡献。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

4 种加工用甜橙（Citrus sinensis(L.) Osbeck），包括2 个早熟甜橙品种哈姆林、早金和2 个中熟品种锦橙、特罗维塔，甜橙果实由重庆派森百橙汁有限公司提供，产自重庆忠县，于2018年12月采收。

甲醇、水（质谱级） 美国Honeywell公司；甲酸（质谱级），标准品：芸香柚皮苷（≥98%）、柚皮苷（≥95%）、香蜂草苷（≥98%）、枸橘苷（≥98%）、橙皮苷（≥97%）、新橙皮苷（≥95%）、橙皮素（≥98%）、芹菜素6,8-二-C-葡萄糖苷（又称维采宁-2）（≥95.0%） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

TripleTOF 6600四极杆串联飞行时间质谱仪 美国AB SCIEX公司；LC-20XR超高效液相色谱系统 日本岛津公司；5920R型冷冻高速离心机 德国Eddendorf公司；涡旋振荡器 德国IKA公司；数显糖度计广州爱宕科学仪器有限公司；UM5破碎机 德国Stephan公司；迷你均质机 加拿大ATS公司；R3088旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司；1083型恒温振荡水浴器 德国GFL公司。

1.3 方法

1.3.1 NFC和FC橙汁的制备

果汁样品制备于中华全国供销合作总社济南果品研究院。

NFC橙汁的制备：挑选饱满、无病害的甜橙鲜果，清洗干净后切瓣，剥去橙皮，果肉进行破碎和榨汁，使用干净纱布过滤除去果渣果籽，果汁进行均质和脱气操作后分为3 份，分别采用不同的热力杀菌条件进行处理，包括巴氏杀菌（中心温度80 ℃、10 min）、高温短时杀菌（中心温度90 ℃、30 s）和超高温瞬时杀菌（125 ℃、5 s），杀菌灌装后迅速冷却至20 ℃，然后测定和记录NFC橙汁的糖度值。

FC橙汁的制备：将NFC橙汁置于真空旋转蒸发仪浓缩至（65±1）°Brix，再使用纯净水复配至原始糖度值，水浴加热杀菌（中心温度80 ℃、10 min）后进行热灌装。全部果汁样品灌装后迅速冷却至室温后冷藏，并于1 周内完成样品制备和仪器分析，剩余样品置于-20 ℃条件下储存备用。

1.3.2 样品前处理

将NFC橙汁（n=12）和FC橙汁（n=12）以12 000 r/min离心20 min，取上清液，使用纯净水稀释10 倍，涡旋混合充分，经0.22 μm聚四氟乙烯膜过滤器过滤，转移至1.5 mL进样小瓶中，等待上机检测。每个样品做3 次平行重复。

1.3.3 UPLC-QTOF-MS分析条件

色谱条件：色谱柱使用美国Phenomenex公司的Kinetex C18反相色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流动相A为水（含0.1%甲酸），流动相B为甲醇（含0.1%甲酸）；梯度洗脱程序：0～2 min，98% A、2% B；2～14 min，98%～5% A、2%～95% B；14～17 min，5% A、95% B；17.1～20 min，98% A、2% B；柱温40 ℃，进样量2 μL，流速0.3 mL/min。

质谱条件：采用电喷雾电离源，在正离子和负离子模式下采集数据，喷雾电压分别为5 500 V和-4 500 V。工作气为氮气，雾化气、辅助加热气和气帘气压力分别为50、55、35 psi，离子源温度550 ℃，碰撞能量为35 V，碰撞能量范围±15 V。建立信息关联采集方法结合动态背景扣除，设置一级质谱质量扫描范围m/z100～1 000，二级质谱质量扫描范围m/z50～1 000，在每个循环内同时进行10 个MS/MS扫描（每个50 ms）。

1.3.4 数据处理与化学计量学分析

使用MarkerView 1.3.1软件进行数据预处理。使用自动算法对保留时间0.5～18 min、m/z100～1 000的数据进行挖掘，将得到的峰值数据集输出并导入SIMCA 15.0软件，进行无监督的主成分分析（principal component analysis，PCA）和有监督的正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）。Origin 9.0软件用于箱形图绘制。

1.3.5 差异化合物筛选与鉴定

根据OPLS-DA模型的变量投影重要性（variable importance in the project，VIP）筛选潜在差异化合物，将母离子精确质荷比输入PeakView 1.2软件中提取相应的离子峰，排除二聚体、加合峰和空白样品峰，结合t检验结果筛选出P＜0.05的差异化合物。

物质鉴定借助PeakView软件的Formula Finder功能和MS-FINDER 3.16软件，将未知化合物的一级和二级离子碎片信息输入软件中，对可能的分子式和化学结构进行预测和推导计算，将实验谱图与HMDB（http://www.hmdb.ca/）、MoNA（https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu/）和Metlin（https://metlin.scripps.edu/）等网络数据库和相关文献记载进行对比，结合标准品验证，确定物质结构。

2 结果与分析

2.1 NFC和FC橙汁的UPLC-QTOF-MS代谢指纹图谱分析

图 1 橙汁样品的总离子流图Fig. 1 UPLC-QTOF-MS total ion current chromatograms of orange juice samples

基于高通量的UPLC-QTOF-MS方法分别在负离子和正离子模式下对NFC和FC橙汁样品进行检测，得到不同样品的总离子流图（图1）。负离子模式下化合物的出峰时间主要集中在0.5～1.5 min和7～10 min。由正离子模式扫描所得到的总离子流图中离子峰的数量要多于负离子模式，主要在0.5～2.0、5.5～10 min和14.5～17 min出峰。可以看出在负离子和正离子2 种扫描模式下，NFC和FC橙汁样品的峰形基本一致，但是有部分化合物离子峰的相对丰度存在差异。为了获得尽可能全面的橙汁样品代谢物信息，后续分析将围绕着2 种模式的数据进行。

2.2 NFC和FC橙汁的化学计量学分析

使用MarkerView软件处理利用UPLC-QTOF-MS技术在正离子和负离子模式下采集的原始数据。进行峰识别和对齐后，得到一个包含母离子质荷比，保留时间和离子相对丰度的数据矩阵，选择矩阵中的单一同位素峰并去除空白离子峰后，分别在正离子和负离子模式下提取到1 705 个和956 个峰，然后将数据集导入SIMCA软件进行PCA和OPLS-DA。

图 2 负离子（A）和正离子（B）模式下NFC和FC橙汁样品的PCA得分图Fig. 2 PCA score plots of NFC and FC orange juice samples in the negative ion (A) and the positive ion modes (B)

PCA够降低复杂多变量数据集的维度，并对其进行可视化，同时尽可能地保留原始数据中存在的信息[20]。不同离子的相对丰度数值存在巨大差异，会显著影响PCA的数据方差，因此在分析前对数据执行Pareto缩放以降低各个变量间的丰度差异。PCA结果显示，在得分图中蓝色的NFC橙汁样品点和绿色的FC橙汁样品点分布有所离散，说明两者的代谢成分存在一定差异，但是不能实现完全分离。组内样本点分布较为分散，这可能是受到甜橙品种、成熟度、生长气候和杀菌条件等因素的影响。R2和Q2是数据模型质量参数，数值越接近1说明模型的拟合效果和预测能力越好。本实验中，使用负离子模式数据生成的PCA模型的质量（R2=0.806，Q2=0.524）优于正离子模式（R2=0.608，Q2=0.331），样品的聚类分离效果也相对更好（图2）。

为充分提取2 组样本间的差异信息，进一步采用有监督的OPLS-DA数据。由于在建立模型时预先提供了分组信息，可以有效降低组内个体差异对模型的影响，有利于排除无关变量而将组间差异放大，增强模型的解释能力。本实验以降低品种和杀菌等条件的影响，放大NFC和FC橙汁的组间差异为前提，建立了OPLS-DA模型。如图3所示，NFC和FC橙汁的样品点分布在不同区域并且明显分为2 个簇，实现了对2 类样品的完全区分，结果表明2 种果汁样品在代谢物种类和（或）含量上存在差异。在OPLS-DA中，主要通过参数指标和Q2对模型质量进行评估，负离子模式下= 0.959，Q2（cum）=0.902；正离子模式下模型拟合参数=0.974，Q2（cum）=0.921，说明根据2 种采集模式所得数据建立的OPLS-DA模型都拟合了较多的变量信息，且具有良好的预测能力。

图 3 负离子（A）和正离子（B）模式下NFC和FC橙汁样品的OPLS-DA得分图Fig. 3 OPLS-DA score plots of NFC and FC orange juice samples in the negative ion (A) and positive ion modes (B)

置换检验可验证模型的有效性，防止发生过度拟合。若原始模型的预测能力（即Q2值）大于左边任何一个Y变量随机排列模型的Q2值，在y轴上的截距小于0，可以认为模型质量较好，没有过拟合。图4是200 次循环迭代置换检验的结果，Q2的回归直线与y轴的交点在负半轴，负离子模式R2（0.0，0.522）和Q2（0.0，-0.654），正离子模式R2（0.0，0.668）和Q2（0.0，-0.574），说明建立的OPLS-DA模型稳健可靠。

图 4 OPLS-DA模型的200 次循环置换检验结果Fig. 4 Model validation using permutation test with 200 cycles

2.3 差异化合物的筛选与鉴定

VIP反映了每个变量对各组样本分类判别的影响和解释能力，通常认为数值大于1时，变量对组间分离具有显著贡献[21]。本研究以VIP值高于1.3为条件，根据OPLS-DA模型的VIP值筛选潜在差异化合物，然后对其进行t检验，将P小于0.05的物质认为是NFC和FC橙汁的差异化合物。

由筛选得到的差异化合物使用PeakView软件的FormulaFinder插件进行分子式预测，计算依据是母离子的精确质荷比、同位素丰度比以及二级离子碎片信息，用于分子式计算的元素设置如下：C（n≤50）、H（n≤100）、N（n≤10）、O（n≤20）、P（n≤15）和S（n≤5），质量偏差范围设置在5×10-6。然后利用MS Finder软件解析未知物可能的化学结构，该软件从键离解能、精确质量数、MS/MS碎片信息以及氢重排规则等方面综合考虑，按照加权分数对鉴定结果进行排序，排名靠前说明未知物是该化合物的可能性更高[22]。为了进一步验证鉴定结果，将实验MS/MS谱图与代谢物数据库中的参考谱图以及相关文献报道进行对比和推导。在正离子和负离子模式下经过筛选和鉴定后共得到16 种差异化合物，精确质荷比、保留时间、二级碎片离子和分子式等信息见表1。

表 1 NFC和FC橙汁的差异标记化合物信息表Table 1 Overview of differential marker compounds between NFC and FC orange juices

以几种黄酮糖苷化合物为例，对未知物的鉴定过程进行说明。黄酮苷具有典型的MS/MS碎裂模式，根据准分子离子所丢失片段的精确质量可以判断其结构组成[23]。在正离子模式下检测到化合物M6，保留时间为8.62 min，一级质谱中[M+H]+的精确质量数为581.187 1，计算得到分子式为C27H32O14，二级质谱图中准分子离子[M+H]+丢失鼠李糖或葡萄糖基碎片得到离子[M+H-146]+m/z435和[M+H-162]+m/z419，以及同时失去二糖基团形成的柚皮素苷元离子[A+H]+m/z273。结合色谱分离的保留时间可以实现对同分异构体的区分，在苷元相同的情况下，芸香糖苷化合物的极性大于新橙皮糖苷化合物，前者的出峰时间早于后者[24]，最终结合标准品验证鉴定为芸香柚皮苷（柚皮素7-O-芸香糖苷）。采用这种方法还鉴定出化合物M7为枸橘苷（异樱花素7-O-新橙皮糖苷），M8为橙皮苷（橙皮素7-O-芸香糖苷）。

通过观察化合物M10的二级质谱图发现，在负离子模式下准分子离子峰[M-H]-失去一分子H2O得到碎片[M-H-18]-m/z575，同时还有一系列C-糖苷类化合物的特征离子碎片[M-H-90]-m/z503，[M-H-120]-m/z473，[M-H-120-90]-m/z383和[M-H-240]m/z353[25]，通过谱库检索匹配结合标准品验证，确定该化合物为芹菜素6,8-二-C-葡萄糖苷，是柑橘类中常见的一种黄烷酮糖苷[26]。

2.4 NFC和FC橙汁的代谢差异分析

在本研究中，样品组的区别不是基于某些仅存在于其中一组的特征化合物，而是基于它们的含量差别（离子峰的相对丰度）。FC橙汁中各个差异化合物的相对丰度相比于NFC橙汁均呈现下降趋势，根据箱形图可以直观表达各化合物在NFC和FC橙汁样品中的丰度变化（图5）。综合鉴定结果发现，差异化合物以类黄酮、有机酸及其衍生物和生物碱为主。其中包括8 种类黄酮物质，分别为橙皮素、异樱花苷、橙皮素7-O-葡糖苷、芸香柚皮苷、枸橘苷、橙皮苷、芹菜素6,8-二-C-葡萄糖苷和麦黄酮7-O-新橙皮苷。类黄酮是甜橙中主要的生物活性成分之一，它具有很强的抗氧化活性，已被证明对人体的健康具有诸多益处[27]。温度对类黄酮物质的稳定性和生物活性具有一定影响，影响程度的大小与化合物的结构有关，如羟基化程度和位置、取代基的存在[28]。Lu Qing等[29]研究发现经过长时间加热后血橙汁的总黄酮量降低了22.06%，芹菜素6,8-二-C-葡萄糖苷、橙皮苷和香蜂草苷等含量均下降10%以上，与本研究结果类似，说明加工过程中的热处理会对FC果汁中的类黄酮物质造成显著影响，降低果汁的营养价值。同时，一些黄烷酮（如橙皮苷）属于苦味化合物，它们含量高低还影响着水果及果汁的感官品质[30]。

Citbismine C和Hallacridone为啶酮类生物碱，两者均是自芸香属植物的植物组织中分离得到[31-32]。吖啶酮类是含有氮元素的大环共轭化合物，已被证明具有抗肿瘤、抗癌、抗菌和酶抑制等生物活性[33]。Hallacridone在NFC样品组内含量差异较大，这可能是受到甜橙品种和成熟度等因素的影响，在经过加热浓缩后FC橙汁中该物质的含量显著减少，成分损失较大。

另一类重要的差异物是有机酸类，包括脱氢抗坏血酸、柠檬酸（或异柠檬酸）和阿拉伯酸等6 种成分，它们在FC果汁加工工艺条件下受到的损失要高于NFC。阿拉伯酸是含有羧酸基团的糖酸衍生物，KEGG分析表明其参与抗坏血酸和醛糖代谢途径，被作为途径中L-阿拉伯糖酸脱水酶的底物。柠檬酸和异柠檬酸互为异构体，在MS/MS鉴定中没能对这2 种物质做出区分，但这2 种有机酸都是用于评估橙汁真实性和品质的重要标记物[34]。相比于异柠檬酸，柠檬酸的化学性质要更加稳定，是橙汁中含量最高的有机酸，显著影响着果汁的风味特征[35]。不同于先前的文献报道主要围绕橙汁中抗坏血酸的热损失含量变化、降解动力学规律等进行研究[30,36-37]，本研究发现脱氢抗坏血酸受加工操作的影响，在FC橙汁中含量出现明显降低。脱氢抗坏血酸由抗坏血酸氧化产生，与抗坏血酸具有相同的生理活性。根据抗坏血酸的降解途径可知，若可逆形成的脱氢抗坏血酸继续发生氧化，会使内酯环断裂产生2,3-二酮古洛糖酸，而这一反应不可逆[38]。因此，脱氢抗坏血酸含量的降低也从侧面反映了在浓缩和二次杀菌过程里抗坏血酸成分的流失。

图 5 NFC和FC橙汁的差异标记化合物比较Fig. 5 Comparison of differential marker compounds between NFC and FC orange juices

3 结 论

本研究使用UPLC-QTOF-MS技术测定NFC和FC橙汁样品中尽可能多的代谢组成分，利用OPLS-DA模型实现了对2 种果汁的区分，以OPLS-DA的VIP值高于1.3和t检验结果P小于0.05为条件，筛选和鉴定出包括类黄酮、有机酸类和生物碱类等在内，共16 个丰度具有显著差异的化合物，经过对比发现，这些差异物在FC橙汁中的含量均低于NFC橙汁。为尽可能贴近工业上的实际生产工艺，本实验采用了巴氏杀菌、高温短时杀菌和超高温瞬时杀菌3 种热杀菌方式分别对NFC橙汁进行处理，但在分析时未就杀菌条件进行比较，而是通过建立有监督的OPLS-DA模型放大NFC和FC橙汁间的差异，专注于探究经过浓缩复配加工后橙汁样品中代谢组分发生的共有变化，结果证明代谢组学分析方法可以用于阐明NFC和FC橙汁间的代谢物差异，并为NFC橙汁鉴别提供方法和数据参考。