基于9 种风味物质的利川红SPME优化及PLS-DA风味识别

程 超，夏兰欣，杜芬妮，李 伟，田 成

（1.湖北民族大学生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；2.生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000）

香气是评价和衡量茶叶品质的重要指标之一，同时也是指导消费者进行茶叶消费的重要导向之一[1]，红茶中风味物质的种类和含量直接影响红茶香气和香型，因此红茶风味成分与香气品质的关系一直是茶叶科学的热门研究领域，尤其是茶叶产地对风味的影响受到了日益广泛的关注，发现不同地区、不同品种红茶香气具有特异性[2-3]。同种茶叶采用不同工艺，同一工艺利用不同原料加工而成的红茶风味不同，因此红茶风味与产地生态条件有很大关系，而风味物质可作为鉴别红茶地理来源的指标[4]。

Owuor等[5]通过比较世界主要红茶香气组分发现，红茶香气成分的重要风味物质可分为两组，第1组包括反-2-己烯醛、己醛、1-戊烯-3-醇、顺-3-己烯醛、顺-2-戊烯醇、顺-3-己烯醇、反-2-己烯醇、戊醇、正己醇、(E,E)-2,4-庚二烯醛等；而苯甲醛、苯乙醛、苯甲醇、芳樟醇及氧化物、水杨酸甲酯、香叶醇及β-紫罗酮等能给红茶带来花香，为第2组化合物。

目前普遍认为气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）联用技术是最为简便高效的分析鉴定茶叶风味物质的方法，但风味提取是最为关键的一步[6]。偏最小二乘-判别分析（partial least squaresdiscrimination analysis，PLS-DA）是一种用于判别分析的多变量统计方法，该法可解释样品观测数目少，减少变量间多重共线性产生的影响[7]。本法有利于对样品不同产地[8-12]、不同加工方式[13-15]、不同质量品质[16-19]等的快速鉴别，此技术近几年已经广泛应用在代谢组学[20-22]和风味组学[23]的研究中。

湖北恩施州利川红茶已有170多年加工历史，1951年利川被国家列为宜红工夫红茶主产区，2017年利川红被国家质量监督检验检疫总局批准为国家地理标志保护产品，2018年担任国宾用茶。近两年利川红发展迅速，但目前对利川红风味物质的研究较少[24]，缺少有力的风味品质研究的基础理论支撑，利川红虽为宜红主产区，但不同的地理位置赋予了利川红特殊的风味品质，因此尚需深入研究。

本实验结合Owuor理论首先确定利川红中重要的风味物质，以此为基础通过单因素试验和Box-Behnken试验优化其固相微萃取条件，同时对利川红、宜红、滇红的风味进行对比分析，通过OPLS-DA进行风味预测，以期为利川红风味品质提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

利川红：由利川市根之润饮料公司提供，一芽二叶，小叶种；滇红：购于恩施颜如玉茶叶公司，大叶种，一芽二叶；宜红：购于恩施颜如玉茶叶公司，小叶种，一芽二叶；所有红茶粉碎成粉末过80 目筛，备用。

正构烷烃（C8～C40）（色谱纯，纯度＞98.0%）美国Sigma-Aldrich公司；氯化钠（分析纯） 武汉市中天化工有限责任公司。

1.2 仪器与设备

50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头、手动固相微萃取进样器 美国Supelco公司；顶空瓶（15 mL） 德国IKA公司；BS224S电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司；HWS12电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；6890-5973 GC-MS联用仪 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 料液比对利川产区红茶风味物质的影响

首先将50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头在250 ℃老化2 h，至无干扰峰出现为止，备用，下同。称取1.00 g红茶粉末于固相微萃取专用顶空瓶中，分别按料液比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（g/mL）加入60 ℃超纯水，加入0.2 g NaCl，用聚四氟乙烯/硅橡胶隔垫立即密封，将固相微萃取顶空瓶置于磁力搅拌器上60 ℃水浴，插入已老化好萃取头平衡10 min后推出纤维头，萃取吸附50 min，移出萃取头后立即插入GC-MS进样口，250 ℃解吸3 min进样测定，每个试验重复3 次[25]。

1.3.2 萃取温度对利川产区红茶风味物质的影响

称取1.00 g红茶粉末于固相微萃取专用顶空瓶中，加入0.2 g NaCl和5 mL超纯水，用聚四氟乙烯/硅橡胶隔垫立即密封，将固相微萃取顶空瓶置于磁力搅拌器上水浴加热，温度分别为40、50、60、70、80 ℃，插入已老化好的萃取头平衡10 min后推出纤维头萃取吸附50 min，移出萃取头后立即插入GC-MS进样口，250 ℃解吸3 min进样测定，每个试验重复3 次。

1.3.3 萃取时间对利川产区红茶风味物质的影响

称取1.00 g红茶粉末于固相微萃取专用顶空瓶中，加入0.2 g NaCl和5 mL 70 ℃超纯水，用聚四氟乙烯/硅橡胶隔垫立即密封，将固相微萃取顶空瓶置于磁力搅拌器上70 ℃水浴，插入已老化好萃取头平衡10 min后推出纤维头，分别萃取吸附20、30、40、50、60、70 min，移出萃取头后立即插入GC-MS进样口，250 ℃解吸3 min进样测定，每个试验重复3 次。

1.3.4 Box-Behnken试验组合设计优化萃取条件

选取萃取温度、萃取时间和料液比3 个因素，利用Design-Expert 10.0和Minitab 17.1软件，进行Box-Behnken试验设计（表1）。

表 1 Box-Behnken试验设计的因素与水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.5 GC-MS检测条件

GC条件[26]：DB-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为氦气（纯度＞99.999%），流速为1 mL/min。程序升温：起始温度为40 ℃，保持5 min，随后以3 ℃/min升温至100 ℃，保持1 min，最后以15 ℃/min升温至250 ℃，保持1 min。不分流进样，进样口温度250 ℃。

MS条件：电子电离源；接口温度250 ℃；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV，质量扫描范围35～450 u。

1.3.6 风味成分分析

GC-MS测定的各挥发性组分通过NIST05-Wiley标准谱库进行检索，在总离子流图的色谱峰中挑选出匹配度不小于80，结合相对保留时间，查阅有关文献数据进行定性，并根据香气成分的峰面积值相对定量[27]。利用Design-Expert 10.0和Minitab 17.1软件进行响应面分析。采用SIMCA 14.1软件进行PLS-DA[28]，采用Origin 2018软件进行热图分析。

1.3.7 萜烯指数和保留指数计算

萜烯指数和保留指数按下式[29-30]计算：

式中：n为正构烷烃碳原子数；tx、tn、tn+1分别为物质x和n、n+1碳原子数正构烷烃的保留时间/min。

2 结果与分析

2.1 利川红茶固相微萃取条件优化

图 1 利川红茶风味物质固相微萃取的GC-MS总离子流图Fig. 1 GC-MS total ion current chromatograms of aromatic components extracted from Lichuan Hong tea by SPME

如图1所示，结合Owuor总结结果，选择利川红中匹配度不小于85的物质如2-己烯醛、苯甲醛、苯乙醛、芳樟醇、顺式和反式芳樟醇氧化物、香叶醇、水杨酸甲酯、柠檬醛9 种物质为利川红的重要风味物质。茶叶香气从基质迁移至消费者嗅觉器官除受茶叶本身内在因素影响外，发香条件如茶叶萃取温度、萃取时间等贡献也较大[30-31]。因此为了优化利川红风味成分的固相微萃取条件，考察料液比、萃取温度、萃取时间3 个影响因素，以上9 种风味物质的峰面积为评定指标。

2.1.1 利川红固相微萃取的料液比优化

图 2 料液比对利川红9 种风味物质的影响Fig. 2 Influence of solid-to-liquid ratio on the extraction of nine aroma compounds from Lichuan Hong tea

由图2可以看出，在60 ℃，9 种风味物质仅萃取了7 种，水杨酸甲酯和香叶醇并未萃取出来，7 种风味物质随料液比减小峰面积不断增加，尤其是2-己烯醛和顺式芳樟醇氧化物显著增加。顺式芳樟醇氧化物具有花果香，而己烯醛呈现强烈青草气，但稀释后有清香的感觉，由此可见为使消费者品尝的红茶风味达到最好，不适宜使用过小料液比；同时料液比过大茶汤浓度过高，不能充分浸透茶叶，因此最佳料液比选择1∶5（g/mL）。

2.1.2 利川红萃取温度优化

图 3 萃取温度对利川红9 种风味物质的影响Fig. 3 Effect of extraction temperature on the extraction of nine aroma compounds from Lichuan Hong tea

由图3可知，40 ℃时仅萃取了相对含量高的顺式芳樟醇氧化物，随温度上升至50 ℃，苯乙醛、反式芳樟醇氧化物、芳樟醇开始出现，60 ℃时除水杨酸甲酯和香叶醇外的7 种风味物质均被萃取，温度70 ℃时9 种风味物质全部萃取，继续升高温度这些物质的萃取量有所下降，可能由于低温分子热运动不剧烈，风味物质挥发较慢；随温度升高，分子热运动加剧，高沸点物质挥发，且挥发速度不断增加。但过高温度会使萃取头固有成分解吸，降低吸附及解吸准确率。因此最佳萃取温度选择70 ℃。

2.1.3 利川红萃取时间优化

图 4 萃取时间对利川红9 种风味物质的影响Fig. 4 Effect of extraction time on the extraction of nine aroma compounds from Lichuan Hong tea

如图4所示，当萃取时间为20 min时，水杨酸甲酯和香叶醇无法萃取出来，随萃取时间延长，水杨酸甲酯、香叶醇和其他7 种风味物质的种类和峰面积均有所增加。综合考虑最佳萃取时间选择50 min。

2.1.4 Box-Behnken试验结果

表 2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

以9 种重要风味物质总峰面积为响应值（表2），利用Design-Expert软件可拟合出3 个影响因素的回归方程：

峰面积=5.08×109+0.33×109A+0.47×109B+0.005×109C-0.99×109A2-0.76×109B2-1.09×109C2-0.27×109AB+0.33×109AC+0.31×109BC

通过Design-Expert软件分析可得出，此方程R2=0.974 4，调整R2为94.14%，说明此方程可很好反映3 个影响因素对风味物质萃取的影响。利用Minitab 17.1软件分析可得出红茶的最佳萃取条件水平：A为0.107、B为0.350、C为0.029，即料液比1∶4.11（g/mL）、萃取温度71.75 ℃、萃取时间50.15 min，此时9 种重要风味物质的峰面积为（5.172±0.075）×109，9 种风味物质均能萃取出来。

2.2 利川红茶与宜昌、云南红茶风味物质比较

2.2.1 3 种红茶风味物质的GC-MS测定结果

表 3 3种红茶风味物质的GC-MS成分鉴定Table 3 GC-MS analysis of aroma compounds in three black teas

续表3

续表3

由表3可以看出，3 种红茶中共鉴定出124 种风味物质，宜红、滇红、利川红鉴定的风味物质相对含量分别为92.807%、81.529%、83.166%。从风味物质化学结构看，宜红、滇红风味物质中醇类含量较高，呋喃类、酯类等在利川红中含量较高，此外醛类化合物在3 种红茶中含量均较高。

2.2.2 3 种红茶风味成分相关性分析

萜烯指数是评价茶叶香气品质和特征的一个重要指标，萜烯指数高，则香气宜人，萜烯指数低，则香气高锐[23]。宜红、滇红、利川红萜烯指数分别为0.954、0.773、0.917，利用SPSS软件进行偏相关分析可得，宜红、利川红的萜烯指数的偏相关显著性P值为0.023，这说明二者香气品质相似，在0.05水平上显著相关；而利川红和滇红偏相关显著性P值为0.515，这说明利川红和滇红的香气品质有差异。

图 5 基于重要风味物质的3 种红茶PLS-DA得分图（A）和载荷图（B）Fig. 5 Score (A) and loading plots (B) of PLS-DA based on the important aroma compounds

为了更好地进行3 种红茶风味识别，利用SIMCA 14.1软件对表3的9 种风味物质进行PLS-DA，结果见图5。该建模方法能较好地区分3 种红茶，其中和Q2分别为0.997、0.995、0.991，由图5A可知，提取的2 个成分即可反映总体99.7%的原始变量信息，说明这2 个成分可反映红茶香气的总体情况；在主成分1上，3 种红茶的风味品质可很好区分，但利川红和宜红的差异性要弱于利川红和滇红，这与萜烯指数相关性分析和图6结果一致。各主成分的载荷值代表该主成分对该类物质反映程度的大小。由图5B可知，香叶醇、芳樟醇、顺式和反式芳樟醇氧化物等物质在第1主成分的载荷值较大；2-己烯醛、苯乙醛、柠檬醛、苯甲醛在第2主成分上的载荷值较大。

图 6 3 种红茶风味物质热图Fig. 6 Heat map of flavor components in three black teas

2.2.3 红茶风味成分变量投影重要度（variable importance in projection，VIP）结果

图 7 基于重要风味物质3 种红茶PLS-DA的VIP和置换图Fig. 7 VIP and permutation test of PLS-DA model based on the important flavor compounds

如图7所示，通过PLS-DA的VIP值分析可知，芳樟醇、2-己烯醛、顺式芳樟醇氧化物、香叶醇对3 种红茶风味影响最大，VIP值均大于1，这几种风味成分可作为3 种红茶相互区分的主要特征标志物。通过交互残差验证方差分析得PLS-DA的预测模型P值为1.057×10-6，说明模型对3 种红茶风味预测能力较好。

2.2.4 红茶风味成分PLS-DA结果

图 8 基于全部风味物质的PLS-DA得分图Fig. 8 Score plot of PLS-DA based on all aroma compounds

以红茶中全部风味物质为自变量，进行PLS-DA，如图8所示。拟合模型的Q2分别为0.977、0.988、0.979，这些参数均低于基于重要风味物质的PLS-DA模型；交互残差验证方差分析得P值为2.422×10-5，大于基于9 种风味物质的模型参数，以上结果说明以红茶中9 种风味物质为评价指标，不仅可以进行红茶风味类型预测，而且优于基于全部风味物质的预测能力。

3 结论与讨论

根据利川红GC-MS总离子流图，结合Owuor总结结果，选择利川红中匹配度不小于85的物质2-己烯醛、苯甲醛、苯乙醛、芳樟醇、顺式和反式芳樟醇氧化物、香叶醇、水杨酸甲酯、柠檬醛为利川红的重要风味物质。以此9 种风味物质的种类和萃取峰面积为评价指标，采用单因素试验和Box-Behnken响应面试验优化固相微萃取条件，确定最优料液比1∶4.11（g/mL）、萃取温度71.75 ℃、萃取时间50.15 min，此时9 种重要风味物质的峰面积为（5.172±0.075）×109。

基于利川红最优萃取条件，比较分析利川红、宜红、滇红的风味差异。利川红鉴定出的73 种风味物质中，以呋喃类、醛类物质为主，相对含量分别为21.202%和20.11%，其次是烷烃和酯类，相对含量分别为13.751%和11.662%。宜红鉴定出59 种风味物质，呋喃、醇类、醛类和烷烃，相对含量分别为23.445%、21.04%、19.816%和18.070%。滇红茶鉴定出66 种风味物质，醇类、醛类、呋喃类，相对含量分别为35.587%、15.103%和12.229%。

竹尾忠一等[29]将红茶分为3 种主要香气类型：第1种是以芳樟醇占优势型，第2种是中间型，含有芳樟醇和香叶醇，第3 种是香叶醇占优势型。香叶醇在宜红、滇红和利川红的相对含量分布分别为1.215%、7.667%和1.736%，而芳樟醇及其氧化物的相对含量分别为25.279%、26.151%和19.246%；利川红、宜红中芳樟醇及其氧化物含量远高于香叶醇，因此属于第1种香型，而滇红香叶醇相对含量达到了7.667%，属于中间香型。本实验结果所测实验数据有别于其他研究者[24]，特别是香叶醇的含量差异较大，也可能与选取的样品有关[32]，如所选茶叶的原料产地、茶叶等级、茶叶加工方法、风味物质的萃取方法等。

若以萜烯指数评判红茶的香气品质和特征，宜红、利川红的萜烯指数分别为0.954、0.917，二者香气品质特征显著相关，而滇红为0.773，与利川红香气品质特征差异较大；热图分析结果与此一致。

分别对3 种红茶中所有风味物质和9 种风味物质分析进行PLS-DA显示，以红茶中9 种风味物质为评价指标，不仅可以进行红茶风味类型预测，而且其预测能力要优于基于全部风味物质。此外VIP分析也发现，芳樟醇、顺式芳樟醇氧化物、香叶醇、2-己烯醛对3 种红茶风味影响最大，这几种风味成分可作为3 种红茶相互区分的主要特征标志物。