甜酒曲中优质酵母菌的分离鉴定及其产香特性分析

陈丽花，任丽霞，李东娜，马 霞

（上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418）

米酒是中国传统的非蒸馏低乙醇含量饮料，由糯米或大米糊化后接种甜酒曲发酵制成[1]，由于口感醇厚、营养丰富而广受欢迎[2]。“曲乃酒之骨”，酒曲之所以被称为酒酿造的灵魂，是因为酒曲中含有起糖化、发酵作用的微生物及其产生的各种酶，其中酵母菌是酒曲中最重要的微生物之一，其发酵性能及代谢产物的差异直接影响到出酒率和酒的风味品质。酒曲中的酵母菌主要有两大类，酿酒酵母和非酿酒酵母。酿酒酵母将糖类高效转化为乙醇的同时产生风味物质[3]；非酿酒酵母又称生香酵母，主要利用糖类、蛋白质、氨基酸等物质，生成大量甘油、酯类等物质，起到增香作用[4]。总体来说，优质的酵母菌应满足发酵初期增殖速度快、发酵产乙醇能力强、产生的挥发性香气物质丰富、对高温或高乙醇含量等环境耐受性好等特点。

传统酒曲大多采取开放式培养，具有制作周期长、受气候及温度影响大、品质不稳定且存在一定的杂菌污染隐患等缺陷，因此目前越来越多研究者开始关注优良发酵性能酵母菌种资源的开发利用[5-7]。将优质酵母菌种直接应用于酿酒生产更为安全、高效[8]，且更有利于提高酒的品质[9]。酒的品质和典型性与挥发性香气物质密切相关。顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）联用技术具有分离高效、定性准确、灵敏度高等优点[10-11]，已成为研究香气成分的有效手段并被广泛应用[12-14]。本研究从中国几种特色地方甜酒曲中分离出具有优质发酵性能的酵母并进行鉴定，探讨其发酵和产香特征，以期为提升米酒品质、实现产业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜酒曲样品分别由上海崇明、浙江宁波和湖北宜昌等地酿酒企业提供；甜酒曲（米粉、根霉菌） 安琪酵母股份有限公司；糯米 上海致富酿造有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基 青岛海博生物技术有限责任公司；米曲汁液体培养基参照文献[15]制备；dNTP、TaKaRa LATaqTM聚合酶 宝日医生物技术（北京）有限公司；NaCl（分析纯） 上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

ABI-2720型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Applied Biosystems公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头、SPME手动进样手柄 美国Supelco公司；7890B/5977B型GC-MS联用仪 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 甜酒曲中酵母菌的分离纯化

在90 mL无菌生理盐水中加入10 g甜酒曲，180 r/min振荡摇匀30 min，制备酵母菌悬浮液，采用梯度稀释和平板涂布相结合的方法分离纯化酵母菌[16]。

1.3.2 26S rDNA鉴定和系统发育分析

使用快速DNA提取试剂盒从样品中提取酵母菌DNA，以引物26S-F（5’- GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3’）和26 S-R（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）扩增26S rDNA的D1/D2区。PCR扩增体系：dd H2O 39 μL，10 μmol/L 26 S-F引物和26 S-R引物各1.5 μL， dNTP（10 mmol/L）1.0 μL，5 U/μLTaq聚合酶1.0 μL，10×Buffer（含2.5 mmol/L Mg2+）5.0 μL，20 ng/μL基因组DNA模板1.0 μL，总体积50 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 个循环；72 ℃再延伸7 min。反应完成后，取3 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR扩增片段。PCR产物的测序工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。

使用BLAST将26S rDNA测序结果在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上比对，根据同源性搜索结果，使用MEGA 6.0软件对序列进行分析，采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树[17]。

1.3.3 酵母菌性能分析

分别将酵母菌种子液以1%的接种量接种至不同乙醇体积分数（4%、6%、8%、10%、12%、14%），不同温度（30、36、42、48、54 ℃），不同pH值（3、5、7、9、11）的YPD液体培养基中，28 ℃培养2 d后在600 nm波长处测培养液OD值，考察酵母对乙醇、温度和pH值的耐受性[18]。

发酵力采用CO2失重法[19]测定，产酯量采用皂化滴定法[15]测定。

1.3.4 酵母菌产香分析

将酵母分别按照106CFU/mL接入米曲汁，于28 ℃恒温培养箱中发酵3 d，发酵液过滤澄清后于4 ℃保存备用。将含有1.5 g NaCl和4 mL发酵液的顶空瓶在45 ℃水浴中平衡15 min，老化后的萃取头在45 ℃吸附40 min插入进样口进行GC-MS分析[20]。

色谱条件：毛细管色谱柱为HP-INNOWAX（60 m×250 μm，0.25 μm）；手动进样，进样口温度250 ℃；程序升温：40 ℃，保留5 min，以6 ℃/min速率升至120 ℃，保留2 min，再以8 ℃/min速率升至240 ℃，保留15 min；检测器温度250 ℃；以He为载气，恒流量1 mL/min，不分流进样。

质谱条件：电子电离源，电子能量70 eV；扫描范围10～500 u；离子源温度250 ℃；接口温度250 ℃。将全离子扫描质谱图通过NIST 11文库进行对比分析，并对匹配度大于80（最大值为100）的香气化合物通过峰面积归一化方法进行定量[21]。

1.3.5 酵母菌发酵液的香气感官评定

采用定量描述分析（quantitaive descriptive analysis，QDA）法评价酵母菌发酵液的香气特征类型。感官品评小组由10 位训练有素的品评师（5 男5 女，年龄为23～40 岁）组成，实验在食品感官实验室内进行，样品随机呈现。香气特征描述词的开发和确定参照文献[22]，最终确定为果香、花香、酒香、脂肪香、草香、坚果香和整体香气，强度分为10 档，0～9分别为气味从无到较弱、中等、较强和极强。

1.4 数据统计分析

所有分析均为3 次平行实验的结果；采用SPSS 22.0软件进行统计和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 酵母的遗传鉴定和系统发育分析

从3 种地方特色甜酒曲中经过多次分离纯化共得到12 株酵母菌，采用杜氏管和嗅闻法分别考察其发酵力和产香能力，得到6 株具有优质产香能力的酵母菌株，分别命名为CMY001、CMY002、CMY003、NBY002、NBY003和YCY001。

核糖体DNA中的26S rDNA D1/D2区具有较高的突变率，可作为亲缘关系密切菌株之间的分类研究[23]。对筛选到的6 株酵母菌进行26S rDNA鉴定，在NCBI中用BLAST比较测序结果并采用Neighbor-Joining法构建6 株酵母菌的系统发育树（图1）。经过比对分析发现菌株CMY001、CMY003和NBY003为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），另外3 株为非酿酒酵母，其中菌株CMY002和NBY002为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），菌株YCY001为光滑假丝酵母（Candida glabrata）。

图 1 酵母菌系统发育分析Fig. 1 Phylogenetic tree constructed for yeast strains using Neighbor-Joining analysis based on the 26S rDNA sequence

2.2 酵母的耐受性分析

2.2.1 对乙醇的耐受性

图 2 酵母菌株在不同乙醇体积分数下的耐受性Fig. 2 Tolerance of yeast strains to different alcohol levels

酵母的乙醇耐受性主要与细胞壁、细胞膜的结构有关，乙醇体积分数较高会对酵母有毒害作用[24-25]，导致发酵缓慢甚至中止，因此良好的乙醇耐受性是保证酵母菌发酵顺利进行的前提条件[26]。如图2所示，在乙醇体积分数为4%～14%范围内，6 株酵母均能够生长，但随着乙醇体积分数的增加其生长能力逐渐减弱。YCY001在小于10%的乙醇体积分数下耐受性良好，CMY002在大于10%的乙醇体积分数下耐受性较强。当乙醇体积分数超过12%后，所有酵母菌株的活力均受到抑制。

2.2.2 对温度的耐受性

酵母菌最适生长温度一般为28 ℃左右，发酵过程中会释放热量而导致体系温度升高，因此需要考察酵母对温度的耐受性。如图3可知，随着温度的提升，酵母菌株的活力逐渐减弱。相对而言，NBY002对高温的耐受性最好，其次是CMY001和CMY002。6 株酵母菌在超过48 ℃时，活力均受到极大抑制。

图 3 酵母菌株在不同温度下的耐受性Fig. 3 Tolerances of yeast strains to different temperatures

2.2.3 对pH值的耐受性

图 4 酵母菌株在不同pH值下的耐受性Fig. 4 Tolerances of yeast strains to different pH values

酵母菌最适生长pH值通常为4～5，发酵过程中产生的酸性物质会导致体系酸度的变化。由图4可以看出，酵母菌株在pH 3～11之间均能生长繁殖，pH 5～7范围内均生长良好，在其中NBY003、CMY001、CMY002、YCY001的最适生长pH值为5，而NBY002和CMY003的最适生长pH值为7。酿酒发酵体系的pH值一般都偏酸性，因此所筛选到的酵母菌株均可在酿酒体系中良好生长。

2.3 酵母菌的发酵力及产酯力分析

2.3.1 发酵力分析

图 5 酵母菌株的发酵力Fig. 5 Fermentation ability of yeast strains

酵母发酵产生的乙醇含量与CO2含量有一定正相关关系，繁殖快、发酵能力强的酵母菌能较早地达到主发酵阶段，从而形成生长优势并有效抑制其他不利于发酵的杂菌，初步保证酿酒质量[27]。由图5可知，各酵母菌株的总CO2质量损失趋势一致，且在24～36 h内的质量损失率较高，NBY003的CO2质量损失最大，其次是CMY001和YCY001，说明这3 种酵母菌的发酵力较强。CMY002的发酵起步较晚，CO2质量损失在12～24 h之间变化不大，但在24～48 h表现较好。CMY003和NBY002的CO2质量损失变化不大，发酵能力较弱。

2.3.2 产酯力分析

产酯能力强的酵母可对米酒的感官品质起到修饰、提高作用。如图6所示，在相同发酵条件下各酵母菌株的产酯能力差异较大。王鹏昊等[28]从小曲中筛选到1 株产酯量为2.684 g/L的异常威克汉姆酵母，本研究筛选到的NBY002和CMY003产酯量分别高达5.125 g/L和4.576 g/L。

图 6 酵母菌株的产酯力Fig. 6 Ester production capacities of yeast strains

2.4 酵母菌发酵液的挥发性香气物质分析

2.4.1 不同酵母菌发酵液挥发性香气物质种类及相对含量对比分析

通过SPME-GC-MS得到6 株酵母菌发酵产生的挥发性香气物质如图7所示。6 株酵母菌发酵液中共检测到挥发性香气物质87 种，各酵母发酵液的挥发性成分之间有显著差异，共有的挥发性香气物质有苯甲醇、β-苯乙醇、苯甲酸、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯、丙烯酸辛酯、仲辛酮、2-壬酮、苯酚、2,4-二叔丁基苯酚和正十三烷，其中β-苯乙醇、乙酸苯乙酯和丙烯酸辛酯的相对含量均较高。

NBY002发酵液中共检测到47 种化合物，包括醇类7 种、酸类4 种、酯类13 种、醛类4 种、酮类3 种、芳香类7 种、烃类6 种及其他化合物3 种，其中主要香气成分（相对含量≥2%）为异戊醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸苯乙酯和丙烯酸辛酯。NBY003发酵液中共检测到42 种化合物，包括醇类7 种、酸类6 种、酯类13 种、醛类4 种、酮类2 种、芳香类6 种、烃类4 种，其中主要香气成分为β-苯乙醇、辛酸、乙酸苯乙酯、甲酸异戊酯、丙烯酸辛酯和仲辛酮。YCY001发酵液共鉴定出49 种化合物，包括醇类5 种、酸类5 种、酯类22 种、醛类4 种、酮类2 种、芳香类4 种、烃类4 种及其他化合物3 种，其中主要香气成分为β-苯乙醇、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、甲酸异戊酯、丙烯酸辛酯、苯乙醛和2,4-二叔丁基苯酚。

图 7 挥发性香气化合物的相对含量热图Fig. 7 Heat map of relative contents of volatile flavor compounds

该菌株产生的风味物质种类尤其是酯类物质最多，说明菌株YCY001在米酒中具有较好的应用潜力。CMY001发酵液中共鉴定出41 种化合物，包括醇类7 种、酸类5 种、酯类13 种、醛类3 种、酮类2 种、芳香类6 种、烃类3 种及其他化合物2 种，其中主要香气成分为β-苯乙醇、正己酸、辛酸、正癸酸、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、丙烯酸辛酯和2,4-二叔丁基苯酚。CMY002发酵液中共检测到43 种化合物，包括醇类8 种、酸类6 种、酯类11 种、醛类2 种、酮类2 种、芳香类7 种、烃类4 种及其他化合物3 种，其中主要香气成分为正戊醇、β-苯乙醇、辛酸、正癸酸、丙烯酸辛酯和仲辛酮。CMY003发酵液共鉴定出37 种化合物，包括醇类8 种、酸类6 种、酯类10 种、酮类2 种、芳香类6 种、烃类4 种及其他化合物1 种，其中主要香气成分为正戊醇、β-苯乙醇、辛酸、乙酸苯乙酯、丙烯酸辛酯和仲辛酮。正戊醇、异戊醇、乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、甲酸异戊酯、丙烯酸辛酯、苯乙醛和仲辛酮具有果香，β-苯乙醇、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯和2,4-二叔丁基苯酚具有花香[29]，这些物质会提升米酒香气；正己酸、辛酸和正癸酸有酸乳、脂肪味和汗味，这些物质的较高含量可能会导致米酒风味变差。

米酒中的醇类物质是主要呈香物质，主要来源于发酵、氨基酸转化和亚麻酸降解物的氧化[4]。酯类是米酒中最丰富的挥发性香气成分，由发酵过程中酸和醇的酯化作用形成，也是特殊花果香气的重要基础[30-31]。酸类是影响米酒香气的重要因素之一，但是当浓度过高时，可能会产生不良影响，其含量应控制在适当的浓度范围内[4]。此外，酮类通常是不饱和脂肪酸氧化而成，醛类香气阈值一般较低，它们都是影响米酒风味的重要因素[32]。

图 8 不同酵母所产不同类型挥发性香气物质的相对含量Fig. 8 Relative contents of different types of volatile flavor compounds produced by different yeast strains

如图7、8所示，由于不同酵母菌代谢途径的差异使其发酵产生的香气物质种类及相对含量不同。6 株酵母菌发酵液中的挥发性香气物质中酯类的种类最多且相对含量最高，其中光滑假丝酵母YCY001发酵液中酯类相对含量显著高于其他菌株，Sujaya等[33]发现光滑假丝酵母是巴厘传统米酒brem中的主要酵母菌，Peter等[34]发现光滑假丝酵母与库德毕赤酵母（Pichia kudriavzeviion）共培养时可显著提升葡萄酒的香气。CMY002发酵液中除含有丰富的酯类物质外，呈现水果香气的正戊醇、仲辛酮相对含量也较高。NBY002发酵液中醇类物质相对含量显著高于其他菌株，其中β-苯乙醇相对含量较高。β-苯乙醇是所有样品中都大量含有的主要香气物质且嗅觉阈值较低，具有清甜的玫瑰花香，其在米酒中的相对含量差异会直接影响米酒的品质[35]。CMY002和NBY002是异常威克汉姆酵母，由于其糖苷水解酶活性有助于生成发酵液的香气成分[36]。Izquierdo Cañas等[37]研究发现同一条件下接种异常威克汉姆酵母比不接种发酵的葡萄酒酯类浓度更高，产生的果香味挥发性化合物更多，有机酸浓度更低。

2.4.2 不同酵母菌发酵液呈香差异分析

QDA法是一种综合性的感官评定方法，既能描述样品感官特征，又能清晰展现样品间差异[22]。不同酵母菌发酵米曲汁的香气特征感官评价结果如图9所示，可知不同酵母菌的呈香特征有明显差异。菌株CMY002和CMY003发酵液的果香特征最明显，与GC-MS分析结果中酯类和醇类物质的相对含量高对应；YCY001发酵液的花香和坚果香最浓郁，与GC-MS分析结果中β-苯乙醇、乙酸苯乙酯和醛类的相对含量高对应；CMY001发酵液的脂肪香、草香、酒香评价最高，与GC-MS分析结果中高级醇和正己酸、辛酸、正癸酸等酸类化合物相对含量高对应。6 种酵母发酵的米曲汁中，整体香气评价最高的是YCY001，其次是NBY002。

图 9 不同酵母菌发酵液的香气评价图Fig. 9 Evaluation of aroma profiles produce by different yeast strains

2.4.3 不同酵母菌发酵液香气化合物主成分分析（principal components analysis，PCA）

PCA可以将多维变量简化为尽可能少的变量，且新变量可以尽可能保持原有的信息，是一种化繁为简的统计分析方法[38]。为进一步了解6 种酵母菌发酵液的香气成分和呈香差异，采用PCA模型对不同酵母菌发酵液的香气化合物进行相关性分析，结果如图10所示。PC1的贡献率为80.62%，PC2的贡献率为9.76%，2 个PC的累计贡献率达90.38%，可以很好地反映6 个样品中挥发性成分的全部信息。由图10a可知，菌株YCY001发酵液的挥发性香气化合物与其他发酵液有显著差异，而CMY002、CMY003和NBY003相对聚集，表明这3 株酵母发酵液中挥发性成分的组成差异相对较小。据图10b可知，丙烯酸辛酯、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、甲酸异戊酯、β-苯乙醇、辛酸和苯甲酸乙酯是影响不同酵母菌发酵液风味差异的主要挥发性香气物质。

图 10 挥发性香气化合物的PCA得分图（a）和载荷图（b）Fig. 10 PCA score plot (a) and PCA loading plot (b) of volatile flavor compounds produced by different yeast strains

3 结 论

本研究从甜酒曲中共分离出6 株优质酵母菌，经26S rDNA鉴定发现CMY001、CMY003、NBY003为酿酒酵母，CMY002、NBY002为异常威克汉姆酵母，YCY001为光滑假丝酵母。YCY001在乙醇体积分数小于10%条件下耐受性良好，CMY002在乙醇体积分数大于10%条件下耐受性较强；NBY002对高温的耐受性最好，其次是CMY001和CMY002；各菌株在pH值为3～11下均能生长。发酵力最强的是NBY003，其次是CMY001和YCY001；菌株NBY002和CMY003产酯量较高。SPMEGC-MS分析结果表明，6 株酵母产生的挥发性香气物质主要为酯类，其中菌株YCY001发酵产物中酯类的种类和相对含量显著高于其他菌株，NBY002产生的β-苯乙醇相对含量明显高于其他菌株。从发酵液香气成分的感官评价看，CMY002发酵液由于含有大量的酯类和醇类物质而呈现较强的果香；YCY001由于产生β-苯乙醇、乙酸苯乙酯和醛类等物质较多，发酵液具有较强的花香和坚果香；CMY001发酵液由于含有较多的高级醇和正己酸、辛酸、正癸酸等酸类化合物，呈现脂肪香、酒香和草香，而果香和花香较弱；YCY001发酵液的整体香气评价最高。PCA得分图表明菌株YCY001与其他菌株产香有显著差异；PCA载荷图表明，丙烯酸辛酯、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、甲酸异戊酯、β-苯乙醇、辛酸和苯甲酸乙酯是不同酵母呈现不同产香特征的关键物质。本研究结果可为提升中国传统米酒的风味品质、不同菌种组合发酵以生产不同香气特征的米酒及实现米酒的标准化生产提供一定的参考。