重组Taxus chinensis苯丙氨酸变位酶性质表征及R-β-芳香丙氨酸合成

丰国强，徐文亮，宋 平，李婉珍，陶玉贵，葛 飞，朱龙宝

（安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000）

植物紫衫（Taxus chinensis）中苯丙氨酸变位酶（phenylalanine aminomutase fromTc，TcPAM）参与抗肿瘤药物紫杉醇的生物合成[1-2]，TcPAM催化合成紫衫醇中重要的结构单元β-苯丙氨酸。β-苯丙氨酸是一些天然活性产物的重要结构单元[3-4]，广泛应用于食品和医药等工业领域[5]。TcPAM能够催化α-芳香丙氨酸的异构化，使α-氨基变位至β位形成β-芳香丙氨酸[6-8]，其化学反应式如图1所示。

图 1 TcPAM催化的异构反应Fig. 1 Isomerization catalyzed by phenylalanine aminomutase

目前制备β-苯丙氨酸主要依靠的是不对称化学合成方法[9]，但是存在成本比较高、工艺相对复杂、原子利用率低、副产物多等不足，需要开发经济节约、绿色可持续的合成方法[10]。与化学方法相比利用酶转化法[11]生成β-苯丙氨酸，工艺相对简单，生产方法稳定，生产过程安全绿色，这种方法应用越来越广泛[12]。目前主要利用转氨酶催化合成[13]，但是转氨酶要添加NADH、FADH2等外源辅助因子[14-15]，导致生产工艺操作繁琐，很难实现大规模工业化生产[16]。为此，寻找不需要添加任何外源性辅因子的酶转化方法更具发展前景。PAM由于能以α-芳香丙氨酸为底物，一步催化合成β-苯丙氨酸[17-18]，同时无需添加辅因子，操作简单，适合大规模的工业生产。

目前，已经成功克隆来源于原核生物Streptomyces maritimus[16]、Pantoea agglomerans[19]的pam基因，并成功实现异源高效表达，制备了工业应用的PAM。由于微生物来源的PAM催化α-苯丙氨酸生成的产物β-苯丙氨酸是S构型[20-21]，而作为活性成分的前体物[22]，往往需要R构型的β-苯丙氨酸，为此需要对PAM的基因进一步进行挖掘，表达出能够一步催化合成R构型β-苯丙氨酸的TcPAM。Chirpch[23]和Morley[24]等首先发现自然界中的氨基变位酶，Walker[6]和Steele[7]等克隆表达了来自真核生物T. chinensis的氨基变位酶。为了获得制备大量的工业用TcPAM，对其进行异源表达是一种常见的策略，其中由于大肠杆菌生长速度快，表达量高，遗传背景清楚，是生产工业用酶的首选宿主菌，但是TcPAM在大肠杆菌中进行异源表达时，容易形成无活性的包涵体，导致目前未实现利用基因工程技术手段生产重组的TcPAM。本研究首先化学合成TcPAM的基因（Tcpam），筛选合适的大肠杆菌表达载体，实现可溶具有活性的酶的高效表达，克服形成包涵体的缺陷，用于催化合成R-β-苯丙氨酸，并进行重组酶活力分析，旨在为后续工业上利用TcPAM催化合成R-β-芳香丙氨酸提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌BL21（DE3）、大肠杆菌JM109为本实验室保存；克隆载体pMD18-T和表达载体pET28a（+）、pET32b（+）、pET22b（+） 美国Invitrogen公司；pET-sumo 艾礼生物科技（上海）有限公司；DNA聚合酶、DNA连接酶、限制性内切酶NotI和BamHI TaKaRa（宝）生物股份有限公司；引物、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）、氨苄霉素、卡那霉素、质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；酶活力催化反应底物L-α-芳香丙氨酸、标准品β-芳香丙氨酸美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）基因扩增仪、GelDoc2000型凝胶成像系统美国Bio-Rad公司；VCX2500型超声波细胞破碎仪美国Sonics公司；AKTAprime蛋白纯化仪 美国GE Healthcare公司；高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、QP2010型气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；Z326K型高速冷冻离心机德国Hermle公司。

1.3 方法

1.3.1 基因克隆与表达

根据NCBI提供的基因序列（AY724735.1），送生工生物工程（上海）股份有限公司合成Tcpam，在基因两端分别插入BamHI和NotI的酶切位点，将Tcpam插入克隆载体pMD18-T中，构建成pMD18-Tcpam。利用BamHI和NotI分别双酶切pMD18-Tcpam和表达载体pET28a（+）、pET32b（+）、pET-sumo以及pET22b（+），切胶回收目的基因Tcpam和载体pET28a（+）、pET32b（+）、pET-sumo以及pET22b（+），用T4 DNA连接酶将目的基因与载体pET28a（+）、pET32b（+）、pET-sumo以及pET22b（+）在16 ℃连接12 h，将连接产物转入感受态大肠杆菌JM109中，带有pET32b（+）和pET22b（+）的感受态细胞涂布到含有20 mg/L氨苄霉素的LB平板上，带有pET-sumo和pET28a（+）的感受态细胞涂布到含有卡50 mg/L卡那霉素的LB平板上，于37 ℃培养12～14 h，分别随机选取3 个阳性重组菌落，接种于含对应抗生素的LB液体培养基中培养10～12 h，提取质粒做双酶切验证，然后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序确认基因序列，构建重组表达质粒分别命名为pET32b（+）-Tcpam、pET-sumo-Tcpam以及pET22b-Tcpam和pET28a-Tcpam。

1.3.2 重组菌的表达与分离纯化

将已经构建的pET32b（+）-Tcpam、pET-sumo-Tcpam、pET22b-Tcpam和pET28a-Tcpam分别转入到感受态大肠杆菌BL21中，涂布到LB平板上培养12 h，分别挑取单菌落接到5 mL的LB培养基中，37 ℃培养12 h，取2 mL培养液至200 mL的LB培养基中，于37 ℃培养至OD600nm为0.6，加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG，于16 ℃、200 r/min条件下诱导表达20 h，离心收集菌体，超声破碎（功率300 W，工作1 s，间隔2 s，共12 min），4 ℃、8 000 r/min离心5 min，收集上层清液，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electroporesis，SDS-PAGE）检测酶蛋白表达情况，采用His-TrapTM/FF亲和层析柱进行分离纯化，制备电泳纯的重组酶。

1.3.3 酶活力检测

将适量的重组酶加入至800 μL缓冲液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 9）中，然后加入200 µL 25 mmol/L底物L-α-苯丙氨酸混合，反应体积为1 mL。于30 ℃反应1 h后100 ℃加热5 min终止反应。用C18反相色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）检测产物，流动相为甲醇（0～15 min，甲醇体积分数由10%升高到40%），进样20 μL，柱温30 ℃，流速1 mL/min，检测波长260 nm。酶活力单位的定义：30 ℃条件下每分钟生成1 μgβ-苯丙氨酸需要的酶量为1 个酶活力单位（U）。

1.3.4 重组酶的酶学性质表征

1.3.4.1 温度对酶活力的影响

在pH 9、10～45 ℃测定酶活力，确定重组酶的最佳反应温度。分别将酶在40、45、50 ℃热处理0.5～3 h后在30 ℃测定酶的剩余活力，未热处理酶活力为100%，研究酶的热稳定性。

1.3.4.2 pH值对酶活力的影响

在30 ℃条件下，分别在不同pH值缓冲体系（pH 5～7，25 mmol/L磷酸缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）；pH 7～9，25 mmol/L Tris-HCl缓冲液；pH 9～10，25 mmol/L碳酸钠缓冲液（sodium carbonate buffer，SCB）中测定酶活力，确定重组酶的最佳反应pH值。将酶分别溶解于不同pH值的缓冲体系（pH 8、9、10）中并处理6～36 h，每隔6 h取样测定酶剩余活力，以未处理的酶活力为100%，研究酶的pH值稳定性。

1.3.4.3 金属离子及表面活性剂对酶活力的影响

在30 ℃、pH 9条件下，将不同的金属离子（10 mmol/L，K+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+）和表面活性剂（1 mmol/L，Triton X-100、Tween 80、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB））分别加入反应体系中，检测重组酶活力，以不加金属离子和表面活性剂反应体系的酶活力为100%，研究其对酶活力的影响。

1.3.5 酶法合成β-芳香丙氨酸

分别用苯环上携带不同基团的α-芳香丙氨酸（25 mmol/L，底物苯环上分别携带的基团R为2-NO2、3-NO2、4-NO2、2-Me、3-Me、4-Me、2-MeO、3-MeO、4-MeO）为底物合成β-芳香丙氨酸，在30 ℃、pH 9的条件下反应8 h，采用HPLC检测分析β-芳香丙氨酸的产率或各种α-芳香丙氨酸的转化率。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 表达载体构建

图 2 表达载体NotI和BamHI双酶切验证Fig. 2 Confirmation of expression vector by double enzymatic digestion with NotI and BamHI

对构建的表达载体pET32b-Tcpam、pET-sumo-Tcpam、pET22b-Tcpam以及pET28a-Tcpam进行BamHI和NotI双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。在2 100 bp左右出现目的基因条带，与理论值一致，表明成功构建表达载体pET32b-Tcpam、pE-Tsumo-Tcpam、pET22b-Tcpam以及pET28a-Tcpam，将其送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果与NCBI中Tcpam基因序列（AY724735.1）一致。

2.2 重组菌的可溶表达与纯化

图 3 重组酶表达及利用HisTrapTM/FF纯化酶的SDS-PAGE图Fig. 3 SDS-PAGE patterns of recombinant enzyme before and after purification using HisTrapTM/FF

由图3可知，带有pET32b-Tcpam、pET22b-Tcpam重组子经诱导后不表达，而带有pET28a-Tcpam的重组子经诱导后为包涵体，不能获得可溶性的重组酶，仅有pET-sumo-Tcpam的重组子经过IPTG诱导表达可以得到可溶性重组酶，在70 kDa出现可溶性的目的蛋白条带，条带大小与理论值相同。由于pET-sumo-Tcpam载体带有SUMO融合蛋白表达标签，SUMO融合蛋白有促进重组蛋白的正确折叠和提高重组蛋白可溶性的功能[25-27]，而其他pET载体没有相关的融合蛋白，导致重组子经诱导后为包涵体或者不表达。将重组酶利用HisTrapTM/FF亲和层析柱分离纯化，SDS-PGAE分析纯化产物，获得电泳纯的重组酶，其质量浓度达到0.256 mg/mL。

2.3 重组酶的性质表征

2.3.1 重组酶催化产物分析

标准品（α-苯丙氨酸）的出峰时间为15.1 min（图4a），检测TcPAM催化底物α-苯丙氨酸之后，在13.2 min出现一个吸收峰（图4b），收集并做质谱检测，图4c、d结果显示，酶催化产物与底物的相对分子质量均为166.2，表明TcPAM能催化α-苯丙氨酸生成β-苯丙氨酸。收集出峰时间为13.2 min的产物进行圆二色谱分析，如图5所示，酶催化产物与标准品R-β-苯丙氨酸具有相似的圆二色谱，与标准品S-α-苯丙氨酸的圆二色谱成Cotton效应[28]，表明产物是R构型，与报道来源于微生物的PAM催化产物的构型相反。

图 4 重组酶催化底物和产物的HPLC以及质谱图Fig. 4 HPLC and MS profiles of recombinant phenylalanine aminomutase-catalyzed products

图 5 标准物与酶催化产物圆二色谱Fig. 5 CD spectra of reference standard and recombinant phenylalanine aminomutase-catalyzed product

2.3.2 温度对重组酶活力的影响

图 6 温度对酶活力（a）以及酶活力稳定性（b）的影响Fig. 6 Effects of temperature on the activity (a) and stability (b) of recombinant enzyme

从图6a可知，重组酶的最适温度为30 ℃，酶活力达到4.11 U/mg。如图6b所示，重组TcPAM在40～45 ℃处理3 h时酶活力保持80%以上，在50 ℃处理3 h后仍具有60%的酶活力，表明重组酶的热稳定性较好。

2.3.3 pH值对重组酶活力的影响

从图7a可知，重组酶的最适pH值为9，与目前已知的其他来源的PAM一致[29]。由图7b可知，该重组酶在具有较高的稳定性，在pH 8、9、10的缓冲液处理后，酶活力仍保持在95%以上。

图 7 pH值对酶活力（a）以及酶活力稳定性（b）的影响Fig. 7 Effects of pH on the activity (a) and stability (b) of recombinant enzyme

2.3.4 金属离子和表面活性剂对重组酶活力的影响

图 8 金属离子（a）以及表面活性剂（b）对酶活力的影响Fig. 8 Effects of metal ions (a) and surfactants (b) on the activity of recombinant enzyme

由图8a可知，K+、Fe2+和Ca2+对TcPAM活力影响较小，相对酶活力保持在80%以上；Mn2+、Mg2+和Co3+对酶活力具有一定的影响，相对酶活力保持在60%～80%之间；而Cu2+和Zn2+强烈抑制酶活力，导致酶活力丧失。由图8b可见，4 种表面活性剂CTAB、SDS、Triton X-100和Tween 80对重组酶的活性影响较小，相对酶活力保持在90%以上。

2.3.5 重组酶异构化α-芳香丙氨酸合成β-芳香丙氨酸

TcPAM可以异构化α-芳香丙氨酸合成β-芳香丙氨酸，如图9所示。结果表明，TcPAM催化的区域选择性受苯环上取代基的基团的性质以及位置影响。TcPAM催化α-芳香丙氨酸出现如下的规律，当苯环上携带的R基团是供电子基团时，促进氨基从底物的α位转移至β位，有利于β-芳香丙氨酸的生成，如R基团是4-MeO或4-Me时，其中β-4-MeO-苯丙氨酸的转化率最高达到45%，但当R基团是2-MeO或3-MeO时，产率低于10%，这可能由于MeO基团较大，而酶活力中心的芳香基结合口袋较窄，导致2、3位置有较大的基团时影响其产率；当苯环上携带的R基团是吸电子基团时，氨基不易转移到芳香丙氨酸的β位，难以生成相应的β-芳香丙氨酸，如R基团为4-NO2时，产物仅有少量的β-4-NO2-苯丙氨酸，转化率低于5%。

图 9 重组酶催化不同取代基的α-芳香丙氨酸的转化率Fig. 9 Conversion of α-aromatic alanine with different substituents catalyzed by recombinant phenylalanine aminomutase

3 结 论

经过筛选不同的大肠杆菌表达载体，构建的pET-sumo-Tcpam在大肠杆菌BL21（DE3）中实现高效表达，并获得了可溶性的重组酶TcPAM，采用HisTrapTM/FF亲和层析的方法制备出电泳纯的TcPAM，具有较好的热稳定性和pH值稳定性，能够催化α-苯丙氨酸异构化生成R-β-苯丙氨酸，但其催化效率及形成的产物β-芳香丙氨酸的产率与底物苯环上携带的基团性质及位置相关，其中4-MeO-β-苯丙氨酸的产率达到45%，本研究为开发生物催化合成β-苯丙氨酸点奠定了基础。