冷冻消融去肺动脉交感神经术对脱氢野百合碱联合低氧诱导犬肺动脉高压的疗效研究

陈 浩 林衔亮 夏 印 黄艺生 陈 璟

1 解放军联勤保障部队第九〇〇医院心血管内科，福建 福州 350025 2 福建省人民医院血管外科，福建 福州 350025 3 解放军联勤保障部队第九〇〇医院医学放射诊断科，福建 福州 350025

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）属于进展性恶性疾病，其病理特征是肺血管阻力和肺动脉压的进行性增高，最终导致右心失代偿甚至死亡。PH的临床诊断标准为在静息状态下，海平面高度右心导管测定肺动脉平均 压（mean pulmonary artery pressure，mPAP）≥20 mmHg （1 mmHg＝0.133 kPa）。PH的主要病理生理基础包括血管内皮功能障碍、肺动脉平滑肌细胞异常增殖、血管周围炎症细胞浸润[1-2]。目前，PH的治疗方法主要为药物治疗，如内皮素受体拮抗剂，这些药物可以降低肺动脉压力，但对预后无改善作用，且病死率仍居高不下。因此，越来越多的研究者对PH介入治疗进行了有益的探索。有研究在开胸状态下，对哺乳动物的交感神经分布规律、特征以及外科损伤后肺动脉压力和右心室功能的改变进行了深入、细致的研究，指出局部损伤或干预肺动脉交感神经的完整性和功能后，哺乳动物的肺动脉压力明显改变[3]。基于此项基础研究，陈绍良教授率先提出肺动脉去神经术治疗PH。美国心脏病学学会杂志发表了一项关于经皮肺动脉去神经术（pulmonary artery denervation，PADN）的研究[4]，发现在主肺动脉分叉及左右肺动脉开口处实施PADN术，能够明显改善心肺功能状态，降低肺动脉压力。但肺动脉传统热消融法的消融时间较长，患者的耐受性较差。近年来，心房颤动冷冻消融手术的应用不仅有效缩短了房颤手术时间，还减轻了患者的痛苦，避免了手术后的抗栓治疗，具有很好的应用前景，为去肺动脉交感神经术的应用提供了一个全新的思路。本研究旨在评估冷冻球囊消融（简称冷冻消融）去肺动脉交感神经术治疗PH的疗效，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用15只普通级雄性成年比格犬，7～11月龄，体重8～13 kg。实验动物购于福州振和实验动物技术开发有限公司，动物福利和实验过程均遵循解放军联勤保障部队第九〇〇医院实验动物福利伦理委员会的相关规定。生产许可证号为SCXK（闽）2018-0001，动物合格证号为1108392011000026。饲养于联勤保障部队第九〇〇医院实验动物中心，环境设施合格证号为SYXK（闽）2018-0005，正常饮食，自由饮水。按照随机数字表法将所有实验动物随机分为3组，分别为A组（脱氢野百合碱模型组）、B组（脱氢野百合碱+低氧模型组）和C组[对照组（二甲基酰胺注射组）]，每组5只。

1.2 方法

1.2.1 脱氢野百合碱PH犬模型建立

犬保留自主呼吸状态，进行3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉。首先，采用Mattocks法对野百合碱进行脱氢处理[5]，脱氢后将其溶解于0.1 ml/kg的二甲基酰胺中保存备用。经Swan-Ganz导管进行血流动力学测定，后将脱氢野百合碱（3 mg/kg）注入右心室，4周后重复进行血流动力学测定。采用Seldinger法穿刺右股静脉，置入静脉鞘，经鞘管将5F Swan-Ganz漂浮导管依次送至右心房、右心室、肺动脉，测定中心静脉压、右心房压力、右心室压力、肺动脉平均压（mean pulmonary artery pressure，mPAP）和肺毛细血管楔嵌压（pulmonary capillary wedge pressure，PCWP）。使用Biosense Webster MP 160 NICO电生理记录仪监测mPAP、PCWP和心输出量。模型成功建立的标准为右心导管测量的肺动脉平均压力超过30 mmHg，即可认为建模成功。

1.2.2 脱氢野百合碱联合低氧PH犬模型建立

犬保留自主呼吸状态，进行3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉。首先，采用Mattocks法对野百合碱进行脱氢处理[5]，脱氢后将其溶解在0.1 ml/kg的二甲基酰胺中保存备用。经Swan-Ganz导管进行血流动力学测定，后于第1天一次将脱氢野百合碱（3 mg/kg）注入右心室，第2～28天暴露于低氧[吸入气氧浓度（fractional concentration of inspired oxygen，FiO2）10%]、低 压（380 mmHg）的DWC-300/0.7型动物实验舱（购自山东烟台宏远氧业股份有限公司）中28 d。每周开三次减压室进行动物护理和清洁，所有动物均可以获得足量的食物和水。

1.2.3 冷冻球囊消融去肺动脉神经术

具体方法：（1）3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，按照0.04 mg/kg的剂量肌肉注射硫酸阿托品注射液，于动物房成功麻醉，然后取犬将其仰卧位固定于导管室手术台。备皮后，监测心电图和动脉血压。（2）选取犬左右侧股静脉为穿刺动脉，备皮后，常规消毒、铺巾。（3）行股静脉血管插管，在右侧腹股沟韧带下方2 cm处触及股动脉搏动，于内测0.5～1.0 cm处进行定位，采用18号穿刺针斜面向上进针，针尖指向股静脉处，与皮肤呈30°～45°的角度进针，当有暗红色血液流出时，固定穿刺针，送入导丝，撤出穿刺针；切开表层皮肤，分离皮下组织，暴露股静脉；保持视野清晰，后经导丝置入9F鞘管，退出导丝，经鞘管注入低分子肝素生理盐水抗凝。（4）安装血压监测设备，并记录犬的基线血压。（5）在X光透视下将导引导丝送入肺动脉远端，经导引导丝送入冷冻球囊至肺动脉开口，在肺动脉口部充盈球囊造影证实球囊封堵住肺动脉口，后球囊充气冷冻，分6次间隔冷冻，每次持续1～2 min。（6）置入Achieve导管至肺动脉开口，测量肺动脉交感神经电位，验证肺血管内膜交感神经电位是否成功隔离。

1.2.4 样本采集

（1）血清：使用不含热原和内毒素的试管收集血液，操作过程中避免任何细胞刺激。以3000 r/min的速度对收集后的血液进行离心，离心时间为10 min，将血清和红细胞迅速且小心地进行分离。（2）采用EDTA、柠檬酸盐或肝素对血浆进行抗凝，并以3000 r/min的速度对上清液进行离心，离心时间为30 min。（3）以3000 r/min的速度对细胞上清液进行离心，离心时间为10 min，去除颗粒和聚合物。（4）组织匀浆∶将组织加入适量生理盐水并捣碎，以3000 r/min的速度对上清液进行离心，离心时间为10 min。（5）若样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20 ℃环境下，避免反复冻融，于室温下解冻并确保样品均匀、充分解冻。

1.3 观察指标

比较建模前3组实验动物的一般资料，包括年龄、体重、mPAP、PCWP和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平。测定并比较冷冻消融术前后3组实验犬的血流动力学参数，即能够反映肺动脉压力的指标mPAP、PCWP。使用Biosense Webster MP 160 NICO电生理记录仪监测3组实验犬冷冻消融术前后的mPAP、PCWP。采用犬血管内皮生长因子酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定并比较冷冻消融术前后3组实验犬的 VEGF水平，检测试剂盒由上海极威生物科技有限公司购买提供。

1.4 统计学方法

应用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，组内比较采用配对t检验，组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料以n（%）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组实验犬建模前一般资料的比较

建模前，3组比格犬的月龄、体重、VEGF、PCWP、mPAP比较，差异均无统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1 3组实验犬一般资料的比较（±s）

表1 3组实验犬一般资料的比较（±s）

注：VEGF.血管内皮生长因子；PCWP.肺毛细血管楔嵌压；mPAP.肺动脉平均压

临床特征 A组（n＝5）B组（n＝5）C组（n＝5） F值P值年龄（月） 10.83±0.56 9.72±2.19 10.73±1.06 1.870.08体重（kg） 10.88±2.33 11.27±1.78 10.29±1.75 3.140.09 VEGF（pg/ml）112.00±8.00101.00±14.0099.00±12.004.290.10 PCWP（mmHg） 7.23±3.10 7.43±2.63 8.17±1.26 3.260.08 mPAP（mmHg） 10.27±2.53 11.56±1.44 10.21±3.25 2.670.16

2.2 3组实验犬手术前后PCWP、mPAP、VEGF水平的比较

术前，3组实验犬的PCWP、mPAP、VEGF水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；术后第6个月，A、B组实验犬的mPAP 、PCWP、VEGF水平均低于本组术前，差异均有统计学意义（t＝1.481、2.427、1.743，P＜0.05）。术后第6个月，3组实验犬的mPAP、PCWP、VEGF水平比较，差异均有统计学意义（t＝3.257、1.891、1.0125，P＜0.05）。术后第6个月，B组实验犬的mPAP、PCWP、VEGF水平均低于A组，差异均有统计学意义（t＝2.681、3.569、1.047，P＜0.05，表2）。

表2 3组实验犬手术前后PCWP、mPAP、VEGF水平的比较（±s）

表2 3组实验犬手术前后PCWP、mPAP、VEGF水平的比较（±s）

注：与本组术前比较，aP＜0.05；与B组术后比较，bP＜0.05

指标 时间A组（n＝5）B组（n＝5）C组（n＝5）mPAP 术前30.217±2.645 55.629±2.38610.767±3.545（mmHg）术后14.243±1.258a b12.436±1.689a12.897±1.622 PCWP 术前17.063±1.885 32.342±1.687 8.244±1.927（mmHg）术后 9.369±1.591a b 8.991±2.724a 8.875±2.898 VEGF 术前 257±15 338±16 108±12（pg/ml）术后 114±7a b 98±11a 111±9

3 讨论

近年来，PH的治疗取得了开创性进展。研究发现，一些功能失调的内皮源性通路参与了PH的特征性血管重塑[6]。以功能失调的内皮源性通路为药理学靶点，一些新的介入技术也应运而生，从而被应用于特定的患者。例如，房间隔造口术及肺动脉球囊血管成形术被认为是治疗无法接受手术的PH和手术风险极高患者的一种有效方法[7-8]。近年来，肺动脉去神经术使更多的PH患者获得更多的临床获益。

临床研究表明，交感神经系统在PH患者中会被激活[9]。亦有研究发现，PH患者血浆中的去甲肾上腺素水平升高，并且与肺动脉压力、肺血管阻力有关[10]。交感神经系统的激活可能是PH患者肺血管重塑和右心室功能障碍的促进因素[11]。因此，心率增快和骨骼肌交感神经活性增强是PH患者的主要临床特征[12-13]。但是，降低全身交感神经活性的药物β受体阻滞剂并不能有效降低PH。由此推测，除了PH患者的全身交感神经被激活之外，可能局部交感神经被激活发挥了更重要的作用，为更精准地隔离肺动脉交感神经提供了理论依据。

Zhou等[14]的研究结果表明，PADN可以改善PH动物模型的血流动力学和心脏结构，降低肺动脉压力和肺血管阻力，减轻右心室肥厚，部分逆转肺血管重构。此外，在野百合碱诱导的PH犬中，肺血管收缩、增殖的细胞因子和介质的mRNA的表达水平有所升高；PADN后，这些因子的表达水平明显降低，并且这些效应可持续至少几个月，表明该手术可以永久性隔离肺动脉交感神经。Chen等[4]的研究证实了PADN的安全性和疗效，结果表明，对行PADN术的患者进行3个月随访时的mPAP明显下降，超声指标Tei指数也明显得到改善，但肺动脉传统热消融法的消融时间较长，患者耐受性差。

近年来，房颤冷冻消融手术得到广泛应用，不经缩短了房颤手术时间，还减轻了患者的痛苦，避免了手术后的抗栓治疗，具有很好的应用前景。本研究开展的动物实验证实了不论是在脱氢野百合碱诱导的PH模型中，还是在脱氢野百合碱联合低氧诱导的PH模型中，术后，mPAP和PCWP均会明显降低，血液中的VEGF水平均较术前明显降低；与B组比较，A组实验犬的mPAP、PCWP、VEGF水平均有所降低，差异均有统计学意义。表明局部损伤或干预肺动脉交感神经的完整性和功能后，比格犬的肺动脉压力可发生显著变化，且术后表现出了降低肺动脉压力效果的可延续性。其中，在脱氢野百合碱联合低氧模型的冷冻消融术中，表现出了很好的降低肺动脉压力及VEGF效果，同时说明冷冻消融术在去肺动脉交感神经操作方面的可行性，为PH的未来治疗提供了全新的思路，为未来治疗人类PH提供了先进的手段。

综上所述，冷冻球囊消融去肺动脉交感神经术是治疗PH的一种有效手段，其从神经调节层面降低了肺动脉的高压力。由于PH发病的复杂性，从体液细胞学层面干预PH亦是一个值得探讨的问题[15]。本研究中通过分析结果显示，与其他两种模型相比，冷冻球囊消融去肺动脉交感神经术有效降低了脱氢野百合碱联合低氧模型实验犬的肺动脉压力和VEGF水平，对于出现此种差异的原因仍需进一步进行模型的病理生理分析，亦将是今后的研究方向。