急性Stanford B型主动脉夹层犬模型建立的实验方法研究

罗光泽 戴向晨 潘红瑞 李文健 曲 超 李宏伟 孙 昊 李 鹏 朱杰昌

天津医科大学总医院血管外科，天津 300052

主动脉夹层（aortic dissection，AD）是一种进展快、致死率极高的大血管疾病，其主要治疗方式包括开放手术、杂交手术及腔内手术。近年来，随着腔内技术的不断发展，AD治疗方式逐渐由开放手术向微创治疗转变[1-2]。胸主动脉腔内修复术（thoracic endovascular aortic repair，TEVAR）是目前临床治疗Stanford B型AD的首选治疗方法[3-4]，但实践操作显示该治疗手段尚存在许多技术难题丞待解决，如支架植入后并发症的处理、病理生理学变化、流体力学改变等，这些仍需要通过稳定的动物模型来进行评价[5-6]。因此，构建一种可重复且稳定性好的动物模型在AD的血流动力学研究及腔内治疗方面具有较高价值。本研究通过多机制联合的建模方法成功并稳定建立了急性Stanford B型主动脉夹层（acute Stanford B type aortic dissection，aTBAD）动物模型，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

选用10只成年健康杂种犬[SCXK（津）2016-001]，体重18～25 kg，平均体重（21.1±2.3）kg，24～48月龄。实验动物由天津医科大学总医院普外研究所购买提供，遵守天津医科大学实验动物伦理委员会有关动物实验的规定。

1.1.2 主要实验药品

肝素钙注射液（体积1 ml，1万单位/支）（天津生物化学制药有限公司）、弹性蛋白酶（Elastase）（美国Acmec公司）、氯化琥珀胆碱注射液（西安汉丰药业有限责任公司）、盐酸赛拉嗪注射液（体积2 ml，每支40 mg）（吉林省方正动物药业科技有限责任公司）、苯巴比妥钠（体积1 ml，每支0.1 g）（天津金耀药业有限公司），盐酸肾上腺素注射液（体积1 ml，每支1 mg）（天津金耀药业有限公司），所有实验药品均在使用期内。

1.1.3 主要仪器设备

神经剥离子购自山东新华医疗器械股份有限公司； 超滑超硬导丝购自日本Terumo公司；4F-VER导管购自美国Cordis公司；4～20 mm或6～20 mm球囊扩张导管购自美国Medtronic公司；Matrx Model 3000型动物呼吸机购自Midmark Corporation公司；计算机体层血管成像（computed tomography angiography，CTA）仪器购自德国Siemens公司；数字减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）购自荷兰Philips公司；5-0 Prolene缝线购自美国Johnson&Johnson公司。

1.2 方法

1.2.1 麻醉及开胸手术

采用苯巴比妥钠，5～10 mg/kg肌注麻醉前镇静；盐酸赛拉嗪注射液，1 mg/kg对实验犬进行镇静后麻醉，右侧卧位，向前拉伸左前肢，建立静脉通路后气管插管，予以肌松后给予呼吸通气支持。术野进行常规消毒、铺巾后，沿第3/4肋间开胸，分离显露降主动脉，于动脉切口远近端分别留置阻断带。

1.2.2 分离中膜

分离中膜先提起主动脉阻断带，限制其弹性搏动，纵向切开主动脉外膜至中膜的内1/3层。使用神经剥离子分离中膜间隙，超滑超硬导丝配合单弯导管（4F-VER导管）沿中膜间隙向远端分离，并不断调整导丝导管前进方向，分离长度为5～10 cm，利用4～20 mm或6～20 mm球囊扩张导管由近向远逐步扩张中膜间隙（图1A），球囊至最远端时保持扩张状态，经球囊导管注入弹性蛋白酶注射液（500 U/ml），维持20～30 min后撤出[3]。

1.2.3 建立夹层近端破口

采用阻断钳阻断主动脉切口近、远端，横向剪去 3 mm×7 mm左右内膜（图1B），用5-0 Prolene缝线将远端内膜双角缝至于主动脉侧壁全层，保证近端破口的横截面积占主动脉横截面积的1/2～2/3，使夹层内膜破口处于开放状态（图1C）；最后缝合外膜（图1D）。

图1 术中建模过程

1.2.4 低剂量肾上腺素升压

松开主动脉阻断钳，同时放松远近端阻断带；静脉注射肾上腺素（0.03～0.05 mg/kg），使收缩压维持在180 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）以上，同时使用纱布按压主动脉外膜缝合口以防止破裂出血，观察20 min，若无明显出血及其他异常即可关闭胸腔。

1.2.5 术后检查及病理分析

术后即时行CTA或DSA检查，观察夹层形成情况、累及长度等。并于相应时间点处死并解剖实验犬，取主动脉标本实体观察夹层形成情况；另外分别采用苏木精-伊红（HE）染色、Movat染色及Verhoeff's Van Gieson（EVG）染色进行病理学分析，观察夹层形成后中膜形态结构、细胞组织学改变等。建模成功定义为实验动物术后存活至少48 h以上，术后经CTA或CTA检查验证夹层形成且长度至少大于5.0 cm。

1.3 统计学方法

采用描述性统计学方法，计量资料采用（±s）表示，计数资料采用n（%）表示。

2 结果

2.1 夹层形成情况

10只实验犬的夹层建模术后存活率为70%（7/10）。共3只实验犬死亡，其中术中死亡1只，死因为术中主动脉夹层远端外膜撕裂出血，术后取标本可见夹层形成；术后24 h内死亡2只，死因考虑为与术中阻断时间过长引起的心脏衰竭有关，并解剖实验取犬主动脉标本观察，发现均形成夹层且累及长度大于5.0 cm。松开主动脉阻断钳，并同时升压，直视下可观察到夹层立即向远端撕裂，管壁膨大、压力增高，主动脉直径明显较强增粗，管壁变薄。

2.2 术后影像学检查结果

术后即时DSA检查、CTA检查及解剖标本验证夹层结果显示：夹层形成率为100%（10/10）。建模成功率为70%（7/10），其中6例累及内脏动脉；夹层长度为7.5～17.5 cm，平均累及长度（14.54±3.03）cm。通过DSA检查可以动态显示夹层真假腔及撕裂程度、真假腔血流改变、夹层远端及内脏供血情况（图2A）。CTA影像显示夹层真、假双腔形态及累及程度，形成的夹层假腔大于真腔，撕裂分离的夹层内膜片呈条形低密度影（图2B～C）。近端破口均位于距左锁骨下动脉1.5～2.5 cm的降主动脉。

图2 建模术后DSA及CTA检查图

2.3 主动脉标本及病理结果

术后相应时间点处死并解剖实验犬，取血管标本可见主动脉管壁弹性降低，夹层假腔内有血栓形成，夹层累及至腹腔干动脉水平并形成远端夹层破口（图3A）；通过主动脉标本横截面上外观可见夹层假腔明显，其直径占同水平主动脉直径的1/2～2/3，而真腔被压缩（图3B）。HE染色结果显示，夹层主动脉壁呈现出明显中膜分离状态，主动脉壁中膜结构破坏，组织层次紊乱，细胞核减少（图3C）；Movat染色结果显示，可见中膜层结构变化，部分弹性纤维断裂，出现板层分离，外侧壁弹性纤维过度拉伸而出现形态学改变（图3D），其中弹性纤维及细胞核呈紫黑色，胶原蛋白及网状纤维呈黄色，肌纤维呈浅红色。EVG染色法结果显示，可见内脏动脉水平的主动脉管壁组织层次有明显差异，主动脉管壁三层结构分明，而在内脏动脉开口处出现结构变化，内脏动脉弹性纤维减少且趋向于中膜的外1/3层（图3E）；图3F示夹层累及至内脏动脉水平。

3 讨论

目前临床建立aTBAD大动物模型的实验方法主要为腔内和开放手术，已有文献显示，采用开胸手术为主要方式[7-9]。Blanton等[10]于1959年通过外科手术方式建立实验犬夹层模型，但结果显示夹层成模率较低，且多形成局部夹层动脉瘤。后来，国内外在此基础上不断进行改进，同时也获得良好的研究成果[11-14]。Cui等[15]采用“内膜双角缝合”构建了较为明显的夹层真假腔，且AD建模成功率明显提高，达66.7%，但同时结果显示该方法的夹层远端累及并不显著。部分学者也尝试通过腔内手术或机械扩张联合肾上腺素冲击构建aTBAD模型，但研究显示实验动物的病死率和夹层破裂风险均较高，夹层的建模成功率不理想[16-19]。对于aTBAD动物模型的构建，夹层的形成长度和累及范围仍是主要难点，尤其对于累及内脏动脉区的aTBAD动物模型[20]。因此构建更符合临床特点的aTBAD动物模型具有重要的意义和实验价值。

本研究根据以往经验，通过不断改进，最后采用多机制联合的建模法成功建立aTBAD模型。本研究利用超滑超硬导丝配合单弯导管向远端分离中膜层间隙，由于导丝头端具有良好的柔顺性和支持力，同时配合单弯导管头端弯度不断调整导丝导管前进方向，从而建成更多的夹层腔隙或通道，再配合球囊机械扩张，容易形成更大的夹层腔，再经球囊导管灌注弹性蛋白酶充分溶解了中膜层弹性纤维组织等，此过程是在未阻断主动脉的情况下操作完成，可以减少术中并发症的发生，增加了夹层累及长度并且更易于累及内脏分支动脉。本实验建模成功是指建模术后动物存活至少48 h以上并经检查验证aTBAD形成，因此排除急性创伤后并发症及急性夹层较高死亡风险因素等造成实验犬死亡的情况，模型成功率达70%。而术后夹层形成率为100%，并且内脏动脉累及率可达60%，表明本实验的研究方法具有可行性。实验结果显示夹层长度为7.5～17.5 cm，平均累及长度（14.54±3.03）cm。本研究组有熟练的aTBAD动物建模经验，能够不阻断主动脉的同时较短时间内分离主动脉中膜，从而减少术中并发症的发生并且有效地增加的夹层的累及长度。

图3 术后犬主动脉标本及病理结果

本研究还采用“内膜双角缝合”法使AD近端破口维持开放状态，并保证破口大小，防止假腔过大将真腔全部压闭，避免血栓发生形成局部夹层动脉瘤，从而增加了aTBAD建模成功率。术后给予低剂量肾上腺素（0.03～0.05 mg/kg）升高实验犬血压，利于aTBAD快速形成，又可防止动物血压过高引起夹层破裂。

本研究通过多种方法验证夹层形成情况，其中CTA作为确定主动脉夹层的方法，具有重复性强、损伤小的特点，可以更好地显示夹层的范围、破口的位置等。DSA检查可以动态显示出夹层真假腔及撕裂程度，显示真假腔血流改变，以及夹层远端和内脏供血情况。通过HE染色结果观察到夹层主动脉壁呈现出明显中膜分离状态；Movat染色示中膜层出现弹性纤维断裂及板层分离状态；动脉血管EVG染色为内脏分支动脉区的动脉管壁解剖提供更加直观的参考价值。

综上所述，本研究的优势在于aTBAD建模的可控性及增加了夹层累及长度，提高了建模的安全性和有效性。研究不足之处为总体样本量较小，且缺乏对实验犬的长期观察，此外，对于夹层形成后的血流动力学研究仍在进行中，尚无法提供该模型与人类夹层的比较分析。