自建微阵列化学发光免疫分析法定量检测心肌肌钙蛋白I自身抗体及其初步临床应用

何成山，姚晓阳，蒋秀娣，陆志成

（上海中医药大学附属第七人民医院检验科，上海 200137）

心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）是在心肌细胞损伤时被释放入血循环中的，是诊断心肌损伤的重要血清学标志物。cTnI在生理状态下为免疫系统的隐蔽抗原，当心肌细胞损伤时cTnI被释放出来，触发机体免疫系统产生心肌肌钙蛋白I自身抗体（cardiac troponin I autoantibody，cTnIAAb）。1996年，BOHNER等[1]首次在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者血清中发现cTnIAAb。随后的多个研究均证实cTnIAAb可与cTnI检测试剂盒中的检测抗体或捕获抗体竞争结合cTnI的抗原表位，对检测结果造成负干扰[2]。近年来的研究结果显示，除AMI患者外，还有部分扩张性心肌病、心肌炎等患者血清中也存在cTnIAAb，并与患者心肌的慢性炎症、心脏功能受损、心肌损伤后的左室病理性重构和心力衰竭的发生等密切相关[3-4]。因此，检测血清cTnIAAb有重要的临床意义。目前，国内外尚无商品化的cTnIAAb检测试剂盒。文献报道的cTnIAAb检测主要使用cTnI-肌钙蛋白T（troponin T，TnT）-肌钙蛋白C（troponin C，TnC）融合蛋白或cTnITnC融合蛋白作为检测抗原，进行间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），并进行定性检测[3，5-7]。由于ELISA的敏感性和重复性欠佳，且有较多的人为因素可影响检测结果。因此，本研究拟建立一种基于微阵列蛋白芯片技术的定量检测cTnIAAb的化学发光免疫分析法。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年5月—2019年5月上海中医药大学附属第七人民医院门急诊或住院急性冠状动脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）患者500例（ACS组），其中男320例、女180例，年龄（58.8±10.8）岁。所有患者均依据《急性冠脉综合征急诊快速诊疗指南》[8]确诊。入院时采用ARCHITECT i2000全自动化学发光免疫分析仪（美国雅培公司）及配套试剂检测血浆或血清cTnI，结果均＞0.1 ng/mL。排除自身免疫性疾病、肝脏疾病、肾脏疾病、血液系统疾病、恶性肿瘤患者及近期有手术、外伤和感染史的患者。随机选取同期上海中医药大学附属第七人民医院体检健康者100名作为正常对照组，其中男60名、女40名，年龄（53.5±11.2）岁。收集所有对象检测后的剩余血清样本，置于无菌无酶离心管中，-20 ℃保存备用。本研究经上海中医药大学附属第七人民医院医学伦理委员会批准，所有对象均知情同意。

1.2 检测血清cTnIAAb的微阵列化学发光免疫分析法的建立

1.2.1 抗原包被芯片的制备 将硬基质芯片（江苏三联生物工程有限公司）置于含2% NaOH的预处理液中浸泡24 h，用纯水清洗2～8次，再将芯片置于0.5%硅烷水溶液中浸泡30 min。将浸泡好的硬基质芯片置于烤箱中，140 ℃烘烤0.5 h。处理完成的芯片密闭保存。将重组人cTnI-C融合蛋白（上海博阳生物诊断公司馈赠）用稳定剂（江苏三联生物工程有限公司）梯度稀释，采用Nano-Plotter 2.1全自动点样仪（德国GeSim公司）将各种浓度的抗原分别点样于已预处理的芯片上，点样量为20 nL/点。将点样好的芯片分别浸入封闭液中封闭，然后取出芯片，150×g离心1 min，去除残余封闭液，4 ℃保存待用。

1.2.2 微阵列化学发光免疫分析法的建立 采用微阵列化学发光免疫分析法（间接法）检测血清cTnIAAb，检测仪器为SLXP-001全自动生物芯片阅读仪（江苏三联生物工程有限公司）。具体步骤：（1）在芯片杯中加入1∶100稀释的待检血清，孵育30 min；（2）洗涤芯片，将芯片置于辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的抗人IgG溶液中，37 ℃孵育40 min；（3）冲洗芯片，将芯片置于发光底物溶液中，由电荷耦合器件（charge coupled device，CCD）相机读取灰度值。在玻片上抗原点样为1行4个点，以4个点灰度值的平均值作为最终结果，由仪器自动分析图片并给出结果。

1.2.3 实验条件的优化 随机选取cTnI＞0.1 ng/mL的ACS患者血清100份，采用稀释液（江苏三联生物工程有限公司配制）1∶100稀释，采用SLXP-001全自动生物芯片阅读仪筛选出1份信噪比最高的血清样本，作为后续实验条件优化的样本。优化条件以检测结果反应信号高，本底信号低，信噪比最大为最优实验条件。（1）抗原（cTnI-C融合蛋白）浓度的选择。从50.0、25.0、12.5、6.0 μg/mL 4个浓度中选取最优抗原浓度。（2）点样芯片封闭所用封闭液及封闭时间的选择。观察2%人乳、2%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、2%羊乳、2%乳清蛋白的封闭效果；将芯片在不同的封闭液中分别封闭12、24、48和72 h，取出后离心待检。（3）抗体的选择。对不同的抗体（HRP-兔抗人IgG、HRP-山羊抗人IgG、HRP-驴抗人IgG和HRP-鼠抗人IgG，均购自深圳菲鹏公司）进行筛选。（4）自制芯片稳定性的验证。采用加速稳定性试验验证自制芯片的稳定性，取1份高浓度cTnIAAb阳性血清（412.6 AU/mL）；另取20片已制备好的芯片，其中4片即刻点样检测，剩余16片在37 ℃温箱中保存，于第5天、第10天、第20天各取4片点样检测，观察反应灰度值与即刻检测的反应灰度值的差异。

1.2.4 血清cTnIAAb参考区间及标准曲线的建立 采用建立的微阵列化学发光免疫分析法检测100名健康体检者的血清cTnIAAb浓度，以样本反应灰度值的第95百分位数为临界值，并赋值为20 AU/mL，健康人群的参考区间＜20 AU/mL。选择cTnIAAb检测结果信噪比最高的血清，使用血清稀释液从1∶50开始倍比稀释至1∶12 800，采用微阵列化学发光免疫分析法检测cTnIAAb，获得样本各稀释度的灰度值，找出与健康体检者样本临界值对应的发光信号灰度值，并赋值为20 AU/mL，以此计算不同稀释倍数样本中cTnIAAb反应的发光灰度值，绘制cTnIAAb浓度与发光灰度值对应的标准曲线。血清cTnIAAb浓度的单位为AU/mL。

1.3 微阵列化学发光免疫分析法的性能评价

1.3.1 精密度 （1）重复性。取cTnIAAb高值（152 AU/mL）和低值（38 AU/mL）血清样本各1份，1 d内连续检测20次，计算变异系数（coefficient of variation，CV）。（2）中间精密度。取上述高值、低值血清样本连续检测3 d，每天连续检测 5 次，计算CV。

1.3.2 空白限（limit of blank，LoB）和检测限（limit of detection，LoD） 以血清稀释液为样本，每天连续检测5次，共检测4 d，获得20个检测数据，取第95百分位数所在浓度为LoB。根据公式 LoD=LoB+1.645s计算LoD。

1.3.3 线性范围 用血清稀释液将1份高浓度cTnIAAb血清样本从1∶50开始倍比稀释至1∶12 800，采用微阵列化学发光免疫分析法检测，获得各稀释度的发光灰度值，以各稀释度的理论发光灰度值为参比，计算实测值与理论值之间的相关性。以r≥0.99时的最高样本浓度为线性范围上限，LoD为线性范围下限。

1.4 免疫印迹法鉴定cTnI自身抗体的特异性

将15 μg cTnI-TnC融合蛋白或心肌肌钙蛋白C（cardiac troponin C，cTnC）（批号8T57，芬兰Hytest公司）与上样缓冲液混合，95 ℃金属浴加热5 min，恢复至室温后待用。采用100 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，110 V电泳60 min[Biorad PowerPac基础电泳仪（美国Bio-Rad公司）]，将硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜先用甲醇浸泡1 min激活，再将NC膜、滤纸、电泳凝胶在转膜液中充分浸泡20 min，制成三明治结构，20 V电压35 min，将电泳条带转移至NC膜上。NC膜置于5%脱脂奶粉中4 ℃封闭过夜。将cTnIAAb高浓度血清样本（1∶50稀释）、抗cTnI单克隆抗体[批号4T21（820），芬兰Hytest公司]或抗cTnC单克隆抗体[批号4T27（1A2），芬兰Hytest公司]与NC膜室温孵育2 h；用磷酸盐吐温缓冲液（phosphate-buffered saline Tween-20，PBST）洗涤3次，加HRP-羊抗人IgG（1∶500稀释）或HRP-羊抗鼠IgG（深圳菲鹏公司），室温孵育1 h，用PBST洗涤3次。在NC膜表面滴上发光液混合物（上海翊圣生物科技有限公司），曝光后采用Image Guant LAS4000化学发光成像分析仪（美国GE公司）成像。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计分析。呈非正态分布的数据以中位数（M）[四分位数（P25，P75）]表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。采用Spearman相关性分析评估cTnIAAb与cTnI的相关性。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 微阵列化学发光免疫分析法实验条件的优化

2.1.1 包被抗原 cTnI-TnC融合蛋白浓度的选择 50 μg/mL cTnI-TnC融合蛋白点样获得的信噪比最高，故以此浓度作为芯片点样浓度。

2.1.2 最佳封闭液和封闭时间的选择 2% BSA和2%羊乳本底较高，信噪比降低；2%乳清蛋白本底较低，特异性反应信号值也较低；2%人乳封闭液反应信号强，信噪比最高，且“阴性”样本信号最低。因此，最佳封闭液为2%人乳。以2%人乳为封闭液，封闭12 h，阳性信号的信噪比最高；封闭24 h，反应信号值稍有下降；封闭48 h，芯片反应信号明显降低。因此，最佳封闭时间为12 h。见图1。

图1 最佳封闭液和封闭时间的选择

2.1.3 HRP标记抗体的选择 采用4种HRP-抗人IgG抗体与筛选出的4例cTnIAAb阳性样本和2例cTnIAAb阴性样本反应。HRP-驴抗人IgG抗体、HRP-兔抗人IgG抗体的反应信号较弱，本底信号也较低；HRP-鼠抗人IgG抗体和HRP-羊抗人IgG抗体获得的反应信号强，本底信号尚可，但HRP-羊抗人IgG抗体的信噪比更大。因此，选择HRP-羊抗人IgG抗体为作二抗。 见图2。

图2 酶标记抗人IgG的选择

2.1.4 自制芯片的稳定性 加速稳定性试验结果显示，7 d内cTnIAAb的反应信号值几乎无明显改变，7～14 d反应信号值逐步下降。与即刻检测相比，第14天反应信号值下降约30%，第21天的反应信号值仅为即刻检测的40%。见图3。

图3 自制芯片稳定性评价的结果

2.2 血清cTnIAAb定量检测标准曲线和参考区间的建立

以健康人群血清样本反应灰度值的第95百分位数作为临界值，其相对应的赋值浓度为20 AU/mL，以≥20 AU/mL为cTnIAAb阳性。系列稀释样本的反应灰度值与理论反应灰度值有很好的相关性（r2＞0.99）。标准曲线见图4。

图4 血清cTnIAAb定量检测标准曲线

2.3 微阵列化学发光免疫分析法检测血清cTnIAAb的性能评价

2.3.1 性能评价 （1）重复性。高值和低值样本的CV分别为5.02%和11.26%。（2）中间精密度。高值和低值样本的CV分别为14.13%和7.83%。（3）LoB和LoD。LoB为0.12 AU/mL，LoD为0.23 AU/mL。（4）线性范围。线性范围为0.23～815.00 AU/mL。（5）参考区间。参考区间为＜20 AU/mL。

2.3.2 免疫印迹法鉴定血清cTnIAAb的特异性 （1）cTnIAAb的特异性。采用免疫印迹法检测6例经微阵列化学发光免疫分析法测定cTnIAAb为强阳性的血清样本（标记为1～6号，cTnIAAb浓度分别为103.6、153.9、273.6、368.7、356.8、406.5 AU/mL）和1例cTnIAAb阴性血清样本（cTnIAAb为12.5 AU/mL）。结果显示，cTnI-TnC融合蛋白的相对分子质量为46 000，6例cTnIAAb阳性样本在相对分子质量40 000～55 000处出现明显的反应条带，cTnIAAb阴性血清未见该反应条带，阳性对照条带清晰（图5）。（2）排除抗cTnC抗体对cTnIAAb检测的干扰。因本研究采用的包被抗原为cTnI-TnC融合蛋白，故需先排除cTnIAAb阳性血清中可能存在的抗cTnC抗体与cTnI-TnC融合蛋白中的cTnC抗原反应而出现的假阳性。采用免疫印迹法检测4例cTnIAAb强阳性血清和1例cTnIAAb阴性血清。结果显示，仅抗cTnC单克隆抗体阳性对照（相对分子质量为18 000）在相对分子质量15 000～25 000处出现明显的反应条带，4例cTnIAAb阳性血清和1例cTnIAAb阴性血清在此处均未出现明显的反应条带（图6）。

图5 免疫印迹法验证cTnIAAb的特异性

图6 免疫印迹法检测cTnIAAb阳性血清对抗cTnC单克隆抗体的反应性

2.4 临床标本的检测

以cTnIAAb≥20 AU/mL为阳性。ACS组血清cTnIAAb阳性率为8.4%（42/500），明显高于正常对照组[2%（2/100）]（χ2=5.023，P＜0.05）。在cTnIAAb阳性样本中，有7例样本（ACS患者6例、正常对照者1例）cTnIAAb水平为20～30 AU/mL，有23例样本（ACS患者22例、正常对照者1例）为31～50 AU/mL，有30例样本（均为ACS患者）cTnIAAb水平＞50 AU/mL。

ACS组血清cTnIAAb水平为5.43（3.21～8.35）AU/mL，正常对照组为5.86（3.49～7.82）AU/mL，2个组之间血清cTnIAAb水平差异无统计学意义（P＞0.05）。有76.2%（32/42）的cTnIAAb阳性患者血清cTnI＜0.5 ng/mL，仅有2例cTnI＞10 ng/mL；所有cTnI＞50 ng/mL的样本均未检出cTnIAAb。Spearman相关性分析结果显示，ACS组血清cTnIAAb与cTnI无相关性（r2=0.1，P＞0.05）。

3 讨论

cTnIAAb常在缺血性心肌病、扩张性心肌病、围产期心肌病等各种心肌病患者的血循环中被检出。有研究结果显示，缺血性心肌病患者血清cTnIAAb的检出率为9.2%[9]～21.3%[10]，cTnIAAb水平较高的患者左心室射血分数明显低于cTnIAAb阴性者[11]。在围产期心肌病[12]、长期血液透析[13]、缺血性心脏病[14]等患者中均发现血清cTnIAAb阳性，提示心功能受损。周桑等[3]的研究结果显示，在入院时，cTnIAAb阳性AMI患者的超声心动图结果与cTnIAAb阴性AMI患者并无差异；随访1.4年后，cTnIAAb阳性AMI患者左心室舒张末期容积和左心室收缩末期容积均显著升高。提示cTnIAAb阳性与AMI后左心室病理性重构密切相关。WU等[15]的研究结果显示，cTnIAAb可上调心肌细胞凋亡基因的表达，使心肌细胞凋亡增加。鉴于cTnIAAb具有重要的临床意义，且目前无商品化试剂盒，因此本研究自建了定量检测血清cTnIAAb的微阵列化学发光免疫分析法，并对该方法的检测性能、特异性和临床应用进行了初步评价。

心肌细胞损伤后被释放到血循环中的cTnI可以游离形式或复合形式存在，但游离形式的cTnI非常不稳定，半衰期仅5 min，因此血循环中90%的cTnI以cTnI-TnC的稳定形式存在[2]。因此，本研究选择cTnI-TnC融合蛋白作为检测抗原，建立定量检测cTnIAAb的微阵列化学发光免疫分析法，除有较好的稳定性外，更与病理状态下血循环中存在的cTnI形式相似。本研究对自建检测方法的实验条件进行优化，精密度良好（CV＜15%），标准曲线r2＞0.99，线性范围为0.23～815.00 AU/mL，敏感性高（LoB为0.12 AU/mL，LoD为0.23 AU/mL）。加速稳定性试验结果显示，制备好的芯片在37 ℃条件下可稳定7 d，这提示芯片可在4 ℃条件下稳定60～100 d，基本满足了大批量实验或临床研究的需求。

为了明确自建微阵列化学发光免疫分析法检测cTnIAAb的特异性，本研究采用免疫印迹法进行了验证。结果显示，6例cTnIAAb阳性样本在相对分子质量40 000～55 000处均出现明显的反应条带，而cTnIAAb阴性样本在此位置无反应条带。cTnI-TnC融合蛋白的相对分子质量为46 000，因此该位置出现的反应条带应是血清中的cTnIAAb与电泳膜上的cTnI-TnC特异性结合产生的。由于本研究所用的检测抗原为cTnI-TnC融合蛋白，因此有可能会与血清中的抗cTnI-TnC抗体或抗肌钙蛋白自身抗体结合，导致出现假阳性。为了排除这种可能性，本研究采用免疫印迹法进行验证。结果显示，无论是cTnIAAb阳性血清样本，还是阴性血清样本，与转膜的cTnITnC融合蛋白均无结合反应，在相对分子质量15 000～25 000处均未出现反应条带；只有抗cTnC单克隆抗体出现明显的反应条带。这提示血清中的cTnIAAb仅与cTnI-TnC融合蛋白中的cTnI产生结合反应，具有很好的特异性。

HAGHIKIA等[12]的研究结果显示，表观健康人的cTnIAAb检出率约为6%。TANG等[5]报道的正常人的cTnIAAb检出率仅为0.5%。本研究结果显示，正常对照组cTnIAAb的阳性率为2%。不同研究中cTnIAAb阳性率的差异可能与检测方法、使用的检测抗原等不同等有关。本研究结果显示，cTnI均阳性的500例ACS患者中，血清cTnIAAb的阳性率为8.4%，显著高于正常对照组[2%（2/100）]（P＜0.05）；但2个组之间血清cTnIAAb水平差异无统计学意义（P＞0.05），可能与ACS组cTnIAAb阳性率不高，阴性样本较多，导致ACS患者的cTnIAAb平均水平较低有关。为了研究血清cTnI水平与cTnIAAb之间的关系，本研究进一步分析了cTnIAAb阳性患者的临床资料，结果显示，有76.2%（32/42）的cTnIAAb阳性患者血清cTnI＜0.5 ng/mL，所有cTnI＞50 ng/mL的样本均未检出cTnIAAb。由此可见，cTnIAAb主要在cTnI水平较低的患者中检出，在cTnI水平较高的患者中少见。这是否由cTnIAAb对cTnI的检测造成负干扰，导致cTnI检测结果假性降低所致，尚需进一步研究加以明确。

综上所述，本研究建立的微阵列化学发光免疫分析法可用于定量检测血清cTnIAAb，检测性能基本达到临床应用要求，为cTnIAAb的临床应用提供了较好的方法学基础。