MicroRNA在非酒精性脂肪肝病中的研究进展

杨立英 张贺 刘倩倩 任路平

(河北省人民医院内分泌科，河北 石家庄 050000)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) 是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的肝脏损伤，其病理学改变与酒精性肝病相似，其疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关肝硬化和肝细胞癌〔1〕。NAFLD发病率逐年增加，是当今重要的公共健康问题。NAFLD确切的发病机制尚未完全阐明，最近表观遗传学的发展使人们对NAFLD中基因型与表型的关系有了更深刻的理解。研究表明〔2〕，多种微小RNA(miRNA)异常与肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病和NAFLD有关。MicroRNA是一种由18～25个核苷酸组成的内源性非编码小分子RNA，通过部分抑制或降解靶向的mRNA，在调控基因表达中起重要作用〔3,4〕,参与细胞凋亡、分化、发育、增殖和代谢等广泛的生物学过程〔5〕，最近大量研究表明miRNA失调与NAFLD密切相关，本文对MicroRNA在NAFLD中的研究进展进行综述。

1 与NAFLD发生发展相关的miRNA

1.1miR-122与NAFLD的相关性 miR-122是肝中表达最丰富的miRNA，在调控脂质代谢中有重要作用〔6〕，Cheung等〔7〕研究将非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及代谢综合征患者与健康人的肝脏miRNA进行比较，发现46种差异表达miRNA，其中23种miRNA明显上调，23种miRNA明显下调。这些miRNA的预测靶点包括调节脂质代谢、胆固醇代谢、氧化应激和凋亡的基因。其中，NASH患者miR-122水平低于对照组63%，并且在体外实验沉默和过表达miR-122分析其靶基因，沉默miR-122后，脂肪酸合酶(FAS)、羟甲基戊二酸单酰辅酶(HMG-Co)A 还原酶、固醇调节元件结合蛋白(SREBP)-1c和 SREBP-2表达增加，而过表达miR-122后，上述脂质合成的基因表达减少，推测miR-122的异常表达与NASH有关。一些由化学和饮食干预构建的NAFLD模型的研究进一步证明了miR-122的重要性。Yamada等〔8〕用高脂饲料喂养大鼠构建NAFLD模型，分别在第2、6、10周检测大鼠血清和肝脏miR-122的表达，发现高脂组大鼠血清miR-122表达上调而肝脏miR-122表达下调。既往多数研究发现在NAFLD中肝脏的miR-122下调，但是也有一些相反结论。有研究在临床样本的肝脏穿刺活检发现，和正常肥胖对照组比，NAFLD组的肝脏miR-122表达明显上调〔9〕。还有研究发现，重度脂肪变性患者的肝脏miR-122水平明显高于患者轻度脂肪变性患者〔3〕。最近一项研究发现高脂饮食小鼠肝脏miR-122水平明显高于普通对照组，同时脂质合成关键酶增加，脂肪酸氧化关键酶降低〔10〕。上述差异是否受实验方法和模型区别影响，还需要进一步的研究。有学者认为〔11〕，miR-122的表达和靶基因及对肝脏脂代谢的作用，可能受到营养和能量状态的影响。

1.2miR-185与NAFLD的相关性 Wang等〔12〕研究了miR-185的减少或增加对脂质代谢和胰岛素敏感性的影响。研究以高脂饲料喂养的小鼠和棕榈酸培养的人肝癌细胞株(HepG2)细胞为研究对象，观察到在这两种模型中miR-185显著下调，且miR-185表达水平在棕榈酸培养的HepG2细胞中的降低具有时间和剂量依赖性。在HepG2细胞通过转染方式抑制了miR-185后，参与调节脂肪从头合成和胆固醇的合成的关键基因表达增加，如FAS、3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶a还原酶(HMGCR)、SREBP1c和SREBP2；相反，在HepG2细胞中过表达miR-185导致胰岛素受体底物(IRS)-2表达增加，改善了胰岛素敏感性和脂肪变性；与对照动物相比，高脂肪的饮食小鼠经miR-185治疗后肝脏脂质沉积显著改善并且miR-185的诱导通过上调 IRS-2增强了胰岛素敏感性。体内外研究一致表明了miR-185在肝细胞中调节脂肪酸代谢和胆固醇体内平衡及在改善胰岛素敏感性的重要作用。

1.3miR-21与NAFLD的相关性 研究发现miR-21在NASH患者的肝脏中上调〔7〕，这在高脂饲养的小鼠和脂肪酸干预的细胞中得到进一步证实〔13〕。miR-21主要表达在胆管和肝脏炎症细胞中，antagomir-21(miR-21的拮抗物质)能抑制肝脏miR-21表达，减少肝细胞损伤、炎症和纤维发生。脂肪性肝炎的小鼠和人的肝脏miR-21高表达，同时过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α减少，而在PPARα缺陷小鼠中，antagomir-21的作用丧失。PPARα 可能是miR-21影响NAFLD的主要靶点〔14〕。

在高脂饮食诱导的小鼠的研究中发现〔15〕，敲除miR-21/miR-21*的小鼠的糖耐量减低，脂肪变性及肥胖均得到改善。特异性地在肝细胞中缺失miR-21/miR-21*也得到类似改善，表明肝脏miR-21/miR-21*在与饮食诱导的肥胖相关的代谢紊乱中的关键作用。进一步的分子机制研究表明，肝细胞中的miR-21/miR-21*缺失增加了胰岛素敏感性并调节了脂肪酸摄取、脂肪的脂质从头合成、糖异生和葡萄糖输出等多种关键代谢转录因子的表达〔15〕。miR-21 可能是非酒精性脂肪肝和代谢综合征的治疗靶点。

1.4miR-34a与NAFLD的相关性 miR-34a是肝脏中对脂质反应最灵敏的miRNA之一，在高脂饮食的小鼠中miR-34a的表达水平显著上调，且其在人类中的表达水平与脂肪性肝的严重程度呈正相关〔16,17〕。有研究发现病态肥胖受试者的肝脏miR-34a表达增加，推测肥胖者的脂肪性肝炎可能与miR-34a的异常有关〔18〕。Ding等〔19〕研究发现在脂肪变性诱导的肝细胞和高脂肪饮食喂养的小鼠的肝组织中miR-34a水平显著上调，其靶基因PPARα和沉默信息调节因子(SIRT1)明显下调。而沉默miR-34a导致SIRT1和PPARα及下游基因的初始表达增加，激活了中枢代谢传感器腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，从而改善肝脏脂肪变性程度。

1.5miR-451与NAFLD的相关性 NAFLD患者血清miR-451水平较高〔5〕，而在NAFLD患者的肝脏、棕榈酸诱导的HepG2细胞及高脂饮食诱导的NAFLD小鼠的肝组织中，miR-451表达显著降低。miR-451的缺失导致白细胞介素(IL)-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α和核因子(NF)-κB激活，促进肿瘤形成，相反miR-451过表达抑制了这些通路，表明miR-451有预防从单纯性脂肪肝病进展为严重晚期肝病的潜在治疗作用〔20〕。

1.6miR-200c与NAFLD的相关性 Feng等〔2〕发现高脂喂养的大鼠肝脏和游离脂肪酸诱导的HepG2细胞miR-200c表达上调。最近的研究一项中，给予miR-200c敲除的小鼠蛋氨酸和胆碱缺乏饮食(MCD)，发现miR-200c缺乏增加了微粒体三酰甘油转移蛋白，减轻了肝脏脂肪变性和炎症〔21〕。

2 循环miRNA可能成为NAFLD的诊断工具

大多数NAFLD患者无症状，在临床实验室检测中偶然发现。目前NAFLD的筛查方法多采用超声和CT扫描，耗时较长。肝组织穿刺活检是评价NAFLD患者分期的金标准。然而，肝组织穿刺是一种有创的侵入性技术。循环miRNA有望成为NAFLD的筛查和疾病严重程度判断的简单方法。

大量研究表明，多种miRNA可在血清和唾液等各种体液被检测到〔22,23〕，因为外界RNA酶几乎无处不在，细胞外miRNA通常是短暂的，而短序列的内源性循环miRNA已被证明是非常稳定的，表明其有作为健康和疾病的生物标志物的潜在作用〔22,23〕。对循环miRNA的分析表明，血液中miRNA携带的粒子有不同的形式，循环miRNA可存在在非膜核糖核酸蛋白复合物中且与Ago2直接结合，还可能与各种脂蛋白结合，此外，miRNA还可以细胞外囊泡(ev)包膜的形式释放。在正常情况下，存在于非膜核糖核酸蛋白复合物中且与Ago2结合的循环miRNA占主导地位，而疾病状态与ev包膜的循环miRNA有密切关系〔23,24〕。越来越多的证据表明，NAFLD中ev包膜的miRNA与脂肪毒性引起的肝细胞损伤有关〔25〕。

很多学者对循环miRNA与NAFLD的关系进行了大量研究，其中对miR-122的研究最为广泛。在一项关于循环miRNA与肝纤维化严重程度和肝细胞癌发展之间关系的研究中，发现与19名健康对照人群相比，34例NAFLD患者的miR-122、miR-34a和miR-16显著升高，并与疾病严重程度呈正相关〔26〕。

Csak等〔27〕研究发现在蛋氨酸-胆碱缺乏性饮食诱导的NAFLD小鼠的血清中循环miR-122水平明显升高，由于miR-122水平与血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平相关，该研究认为循环中miR-122的升高可能是其从受损肝细胞释放的一个指标。随后对高脂肪饮食诱导大鼠NAFLD的研究发现，在没有血清ALT变化的情况下，miR-122水平升高了10倍，这表明血清miR-122水平可能是NAFLD早期的生物标志物〔8〕。

在一项检查血清miRNA的预测价值研究中，发现其中9个miRNA(miR-34a，miR miR-192，miR-27b，miR-122，miR-22，miR-21，miR-197，miR-30c和miR-16)与NAFLD严重程度相关。 此外，与药物诱导的肝损伤患者相比，miR-192，miR-27b，miR-22，miR-197和miR-30c可能对NAFLD具有特异性〔28〕。

虽然循环miRNA是备受关注的生物标志物，但循环miRNA与肝病之间的因果关系尚不完全清楚。目前还不确定循环miRNA的释放是肿瘤特异性的还是肝脏来源的〔22,29〕。此外，估计在血清或血浆中约有100～500个循环的miRNA，而在肝脏组织中发现的miRNA数量明显更高，这表明除了关注循环miRNA，同时也要重视基于组织的miRNA研究，从而更全面地揭示全部范围miRNA在NAFLD发生发展中的作用。

3 miRNA可能是NAFLD的治疗靶点

miRNA在基因表达调控中的有重要作用，因此有可能是有意义的治疗靶点。由于miRNA通常通过抑制基因转录来发挥作用，所以实践中可通过沉默来抵消miRNA的抑制作用，或者恢复对miRNA对靶向基因的抑制作用，从而发挥其干预作用。已有一些相关研究为肝脏疾病的治疗提供线索。有研究者发现，在肝细胞癌(HCC)细胞中miR-21上调，故通过反义寡核苷酸抑制miR-21导致HCC细胞迁移和克隆受到抑制，并且诱导了HCC细胞系的凋亡和坏死〔30〕，肝癌生长对miR-21的依赖也在异种移植瘤模型中得到证实〔30〕，这为抑制miR-21治疗HCC提供了支持，使其成为一种有希望的药物干预手段。

另外，miR-122在HCC中下调，其在肝癌发生中的作用有待阐明〔31〕。Miravirsen是一种用于抑制miR-122的锁定核酸修饰的反义寡核苷酸，以肝脏表达的miR-122为靶向，是治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的新药，目前已经进入2期临床试验阶段，由于miR-122在肝脏中表达较多，除了参与丙肝病毒的复制，还与胆固醇调节和脂代谢密切相关，对NAFLD具有潜在的治疗作用〔32〕。

综上，miRNA对基因表达的调控及其与NAFLD的关系已成为当今生物医学领域研究的热点。由于方法上的进步，通过微阵列分析和二代测序技术来鉴别miRNA的表达变得更容易、更全面。循环miRNA可能为更可靠的生物标志物。在防止非特异性效应的前提下，为了治疗目的而模拟或抑制miRNA的方法将越来越完善。miRNA研究的深入发展对人们对NAFLD发病机制的阐明、预测和治疗具有重要意义。