激素性股骨头坏死中细胞自噬的作用

陈俊名 刘又文 何沛霖 张虹 张俊涛 孙含瑞 岳辰

(1福建中医药大学，福建 福州 350001;2河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院);3河南中医药大学)

股骨头坏死(ONFH)是骨科常见的一种由多种因素造成的疾病〔1〕。长期或短期过量使用糖皮质激素(GCs)是发生ONFH的常见诱因，其中长期过量使用GCs会有超过40%的人群发生激素性股骨头缺血性坏死(SONFH)，SONFH是一种代谢性疾病，其发病特点为多位双侧发病，且坏死范围较大，发病年龄主要为中年及青年，研究发现其进展具有不可逆性〔2〕，且目前缺乏有效的治疗方法。SONFH有许多发病机制，如破坏成骨分化和脂肪形成分化之间的平衡，脂肪栓塞，循环障碍，细胞凋亡和功能障碍，髓内压力变化及凝血功能障碍〔3，4〕等。GCs作用下细胞凋亡及正常细胞活性受抑的原因尚不完全明确，有观点表明：在SONFH发生、发展过程中，细胞凋亡及正常骨活性受抑与其细胞自噬失调密切相关〔5～7〕。

1 细胞自噬

1.1细胞自噬的概念 自噬(Autophagy)即指细胞通过产生“自噬体”吞噬胞内衰老、失能的细胞结构并与溶酶体融合后通过水解酶将上述物质降解并回收利用的过程。当细胞处在饥饿、内质网应激、辐射、缺氧等条件刺激下，便会转录并表达自噬的相关基因(ATG)并将在细胞内形成自噬体，自噬体随后与溶酶体结合后吞噬胞内衰老、失能的细胞结构，降解回收胞内异常大分子化合物和受损细胞器〔8～11〕，最后这些小分子物质透过溶酶体进入细胞质，重新参与细胞能量代谢。该过程为细胞生存提供能量前体物质，是细胞的自我保护行为，是机体适应伤害性刺激的表现，该过程在维持细胞稳态、细胞正常功能、抑制细胞凋亡、促进细胞发挥正常功能方面发挥重要作用〔12，13〕。自噬的种类主要分三种，包括巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)及分子伴侣介导的自噬(CMA)〔14〕。

1.2细胞自噬的分子生物学过程 自噬的过程是一个连续动态的自我保护过程，其中自噬体形成是细胞自噬的重要环节，通过对微生物的观察发现，细胞自噬主要分为5个阶段，细胞自噬相关基因ATG约为35种，这35种ATG在自噬体形成的过程中，每一种ATG各自表达所产生的功能不一样，整个自噬过程与自噬相关基因关联密切〔15〕。有研究表明：当细胞在消耗营养的过程中，雷帕霉素复合-1(mTOR-1)会被抑制，然后形成ULK1-ATG13-FIP200复合体(ULK1-ATG13-FIP200)，自噬正调控蛋白是提高自噬活动性的重要调节蛋白，随后ATG5与ATG12相互结合，成为ATG5与ATG12的复合体，其在微管相关蛋白的促进和驱使下会相互连接进一步形成微管相关蛋白1轻链3(LC3)，当形成自噬体标记蛋白后，由于这些蛋白的所处环境及特性会在已形成的自噬体膜上发生连接反应，形成最终的自噬体〔16〕。当自噬被激活时，自噬活动便开始，已成形的自噬体会包裹机体不再需要的细胞器及蛋白质聚合体，并携带需要回收的细胞器与蛋白质聚合体与溶酶体进行融合，这个过程会将这些物质进行分解重吸收后合成新的大分子。其中重要的调节因素包括了mTOR-1、丝氨酸、P62等。研究表明：mTOR可以使Atg13磷酸化，磷酸化后不能再与Atg1结合，便不能促进细胞内自噬的发生〔17〕。正常情况下，细胞自噬处于低水平状态，当处于异常的情况下时，细胞自噬会被激活从而具有保护功能，但是只有处在适度的自噬状态下才会起到保护细胞的作用。自噬失调包括了自噬活性过低和自噬活性过高，二者都会抑制细胞自噬正常功能，介导细胞凋亡并对机体产生损害〔18，19〕。当细胞自噬活性过低时，细胞自噬无法正常及时清除细胞内受损、失能的细胞器及蛋白质聚合体，细胞内物质无法循环利用，自我保护能力降低。而当细胞自噬活性过高时，自噬性溶酶体会吞噬异常及一些正常的细胞器及蛋白质聚合体，细胞正常结构也会因此受损〔20，21〕。

2 SONFH与细胞自噬

2.1SONFH发展过程中细胞自噬的相关信号通路 自噬是复杂的生物学过程，与之相关的信号通路有多条〔22〕，现有研究发现与SONFH有关的细胞自噬信号通路主要包括磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路与磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信号通路。研究表明mTOR可分为mTORC1和mTORC2，其中mTORC1是细胞自噬调节过程中的主要蛋白。

AMPK/mTOR是调控自噬最为关键的信号通路〔23，24〕。其调控细胞自噬的途径为：AMPK/mTOR信号通路中关键酶为AMPK，它由α、β、γ三个亚基构成，γ亚基为AMP及ATP的结合位点；当各种原因导致胞内AMP水平升高，ATP水平降低时，更多的AMP会与γ亚基结合，AMPK会发生磷酸化并被激活为p-AMPK存在；形成p-AMPK后可直接激活ULK1而启动细胞自噬。而另外一种方式也可通过磷酸化Raptor及TSC2的Ser而对mTOR产生降低活性的作用。mTOR是自噬的主要抑制活性的信号，它的最主要功能是将ATG13磷酸化，使其不能与ULK1结合形成自噬体而关闭自噬启动信号〔25～28〕。因此，AMPK信号通路的激活表现为AMPK激活，mTOR受抑，ULK1被激活而最终启动自噬。PI3K/Akt/mTOR信号通路是细胞自噬经典的信号通路〔29〕，PI3K是一种脂质激酶，参与到细胞增殖及代谢等多种过程，其作用是可以转导下游信号，从其结构特点进行分类主要分为三种类型，其中第一种PI3K是由亚基(P85)和催化亚基(P110)组成一种异二聚体，主要又分为2个类别，第一个子类别为A类PI3Kα，β和δ，其是由p85α，p85β，p55γ三个中的一个和p110α，p110β或p110δ3个催化亚基之一组成；第二个子类别是由调节亚基p101和催化亚基p110γ组成的B类PI3K。Akt PI3K，是PI3K活动下游的直接效应分子，其功能主要是可以调节多个下游信号通路促进细胞的增殖分化及代谢。其中细胞自噬可以通过2个途径被激活，第一个为mTOR依赖途径，第二个为非mTOR依赖途径。第一种途径即PI3K/Akt/mTOR信号通路调控的细胞自噬，现有研究表明，这个信号通路在细胞自噬诱导SONFH中起到了非常重要的作用〔29〕，其中以mTOR为核心的经典自噬通路的研究最多见。

2.2SONFH的病因研究 GCs作用下诱发ONFH是许多疾病使用激素药物治疗后常见的并发症，根据近年研究发现，激素可以诱导成骨细胞和软骨细胞程序性死亡的发生，并且会发生局部无菌性炎症，促进非创伤性ONFH的发生〔30〕。相关动物实验表明：长期及过量应用激素或者在关节内直接注射激素都会增加股骨头坏死的发生概率，其具体机制主要考虑：由于长期及大量激素使用会导致股骨头血供不足，致使股骨头内成骨细胞和骨髓细胞死亡，随着严重程度加重造成股骨头内支撑结构(骨小梁)改变，股骨头随后发生塌陷，并表现为髋部疼痛和髋关节活动受限〔31〕。GCs作用下股骨头细胞凋亡，成骨活性下降，骨修复能力不足，继而导致骨小梁力学强度降低是诱发SONFH的常见机制，是出现股骨头塌陷的重要因素之一〔32～34〕。

而目前国内外对于SONFH的具体机制仍没有完全研究清楚，近年的进展更倾向于研究基因的表达与调控在疾病发生、发展过程中的关系，关于SONFH与细胞自噬的具体机制被学者重视，激素可以导致股骨头血供不足，是发生细胞自噬失调的重要原因〔35〕。研究者倾向于关注自噬及其信号通路在各种疾病的发生发展中的具体机制，目前大多数研究通过研究mTOR的上下游信号通路来确定调控细胞自噬的关键〔36〕。

2.3超量激素引起自噬失调诱发SONFH的机制 在SONFH发生、发展过程中，细胞凋亡及正常成骨活性受抑与其自噬失调密切相关〔5，14，7〕。She等〔6〕发现，SONFH患者坏死骨组织中成骨细胞自噬相关基因表达水平明显高于正常骨组织。通过阻断自噬相关AMPK/mTOR信号通路，成骨细胞自噬表达水平明显降低，但成骨细胞凋亡水平却进一步加重。Li等〔5〕研究也得到相似的结论，并认为对成骨细胞自噬水平的调控将成为SONFH治疗的新靶点。Zhang等〔7〕研究表明，在生理低剂量地塞米松作用下，成骨细胞的自噬被激活(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)而产生自我保护，此时细胞凋亡水平极低。但加入自噬抑制剂后，成骨细胞凋亡水平则明显提高。Han等〔37〕的研究则证实，地塞米松作用下大鼠成骨细胞发生凋亡，成骨活性明显受抑，同时其自噬水平(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，Beclin-1)较正常有所增高。然而，通过自噬激活剂进一步提高成骨细胞自噬表达水平后，细胞凋亡减少，同时成骨活性明显提高。上述结果充分说明GCs作用下细胞自噬失调是导致其凋亡、骨活性受抑，从而诱发SONFH发生、发展的重要原因之一。

AMPK/mTOR信号通路在GCs介导的细胞自噬失调中发挥重要调控作用〔6，27，28〕。GCs是调控机体能量代谢的重要物质，能够诱导胞内ADP/ATP发生变化，通过影响AMPK表达水平而调控mTOR及ULK1的表达量，影响细胞自噬水平〔26〕。相关研究证实SONFH患者坏死骨组织AMPK表达水平明显高于正常骨组织，通过AMPK抑制剂(compound C)抑制AMPK表达水平后，成骨细胞凋亡水平进一步加重〔6〕。Guo等〔27〕的研究表明，通过compound13(AMPK激活剂)提高AMPK的表达水平能够明显提高小鼠成骨细胞的生物活性，抑制其凋亡。另一项研究也通过OSU53(AMPK另一种激活剂)对人OB-6成骨细胞进行类似研究，得到相同结论〔28〕。因此，激活AMPK/mTOR信号通路可能提高成骨细胞自噬水平而减轻其自噬失调程度，抑制凋亡、增强成骨活性，从而成为干预SONFH发病进程的新途径。PI3K/Akt/mTOR信号通路是经典的自噬信号通路之一，研究表明该通路现有已知通路中唯一的抑制性通路，可以通过活化该通路来抑制自噬，保护细胞并抑制其程序性死亡，反之抑制该通路就能诱导细胞自噬和凋亡。其中mTOR是PI3K/Akt/mTOR信号通路种重要组成蛋白，PI3K/Akt通路是mTORC1主要的上游调节剂，抑制ULK复合物的形成，可以阻断内质网膜形成脱落进而对细胞自噬形成负调控〔38〕。在SONFH中可能存在自噬过度活化的现象，过度活化自噬会导致骨坏死的发生，我们可以通过诱导并激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进细胞存活并抑制过度活化自噬，有助于阻碍SONFH的发生及进展〔39〕。

以上研究表明，细胞自噬影响SONFH发生及发展进程中成骨细胞和破骨细胞的相互作用。很早就有研究证实了SONFH发病机制与成骨细胞和破骨细胞的分化及凋亡有关系，而细胞自噬与细胞凋亡同样关系非常密切〔40〕。这些研究表明细胞自噬可以增加或者减少细胞凋亡及增加骨量等，而细胞自噬在SONFH中具有双向调节作用。

3 总结与展望

细胞自噬是真核细胞内重要的维持细胞内环境及稳态的机制，根据相关研究及实验观察证实：长期和过量使用激素可以导致ONFH。SONFH中细胞自噬是程序性细胞死亡研究的热点与难点，近年来的研究充分说明了细胞自噬广泛参与到SONFH的全过程。虽然在自噬的分子机制和调控机制等方面有一些研究进展，但是细胞自噬调控SONFH的作用机制的研究还比较少，就目前而言，仅仅只能说明细胞自噬诱发SONFH有直接或间接的关系，其关系主要有2种：一种是正面调节作用，即细胞自噬活性适当提高可以抑制SONFH坏死的进程，可以改善激素导致股骨头缺血坏死的情况，如果降低自噬活性则会起到相反作用；另外一种是则是负面调节作用，即细胞自噬活性适当降低可以抑制SONFH坏死的进程，可以改善激素导致股骨头缺血坏死的情况，如果提高自噬活性则会起到相反作用。基于现有研究可以展望如果我们在SONFH发病机制中进一步研究细胞自噬并取得突破性成果，我们将有望通过调控(激活或者抑制)细胞自噬来达到改善疾病进程的目的，为SONFH的治疗提供更多可靠的办法和更有效的方案。