RNA结合蛋白ELAVL1与肿瘤进展的关系研究*

陈禹鑫，殷文婕，蒋壮，徐彤，许之阳，周永平，戴途，王浩

[1.南京医科大学第一临床医学院临床医学系，江苏南京210029；2.南通大学医学院临床医学系，江苏南通226019；3.南京医科大学附属无锡第二医院（南通大学附属无锡临床医学院），江苏无锡214002]

胚胎致死异常视觉蛋白1（embryonic lethal abnormal vision like 1/human antigen R,ELAVL1/HuR）是一种参与分化和应激反应的RNA 结合蛋白，主要通过稳定信使RNA（messenger RNA,mRNA）发挥作用[1]。ELAVL1 蛋白包含3 个与其他RNA 结合蛋白具有高度同源性的RNA 识别基序（RNA recognition motif,RRM）。前2 个识别序列（RRM1 和RRM2）在RNA 结合处形成裂缝，而RRM3 对于稳定RNA 蛋白复合物起到重要作用。ELAVL1 蛋白的RRM2 和RRM3 之间存在1 个“基本铰链区”（hinge region,HR），该区域与其他RNA 结合蛋白同源性较低。ELAVL1 蛋白内的HR 区带有一个ELAVL1 蛋白核质穿梭序列，这对ELAVL1 蛋白穿梭细胞核至关重要[2]。ELAVL1 蛋白与靶mRNA 的3'-端非翻译区（3'-untranslated region,3'-UTR）含AU 元素（AU-rich elements,ARE）等元件识别并结合，从而调控靶mRNA 的稳定性和翻译能力[3]。

ELAVL1 蛋白是核质穿梭蛋白。对ELAVL1 蛋白的核穿梭机制，目前发现至少有3 种信号通路与ELAVL1 蛋白的转运有关[4]。第1 种是p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38-MAPK）通路。在胶质母细胞瘤中，未激活的p38-MAPK 与MAPK 激活的蛋白激酶2（MAPK activated protein kinase 2,MK2）以无活性复合物形式存在于细胞核中。白细胞介素-1β （interleukin-1β,IL-1β）激活MAPK 激酶6，后者进一步磷酸化p38-MAPK。活化的p38-MAPK 将MK2 上334 位的苏氨酸残基磷酸化，从而激活MK2，并暴露MK2 与ELAVL1 蛋白的结合位点。ELAVL1 蛋白与IL-6 mRNA 的ARE 结合后，与活化的MK2 形成复合物，触发核穿梭[5]。第2种为蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）通路。PKC是由至少10 种不同的亚型组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。在人系膜细胞（human mesangial cells,HMC）中，血管紧张素II（Angiotension II,AngII）与细胞膜血管紧张素1 型受体（angiotension type 1 receptor,AT1）结合后，激活PKC 并诱导其进入细胞核。活化的PKC 磷酸化RRM3 上318 位的丝氨酸残基，促进ELAVL1 蛋白与靶mRNA 实现核穿梭[6]。第3 种为AMP 激活激酶（adenosine 5'-monophosphate -activated protein kinase,AMPK）通路。AMPK 可以通过多种方式影响哺乳动物蛋白的表达，包括转录激活[7]，蛋白质合成以及mRNA 转录后调控，转录后调控在于AMPK 促进ELAVL1 蛋白从胞质穿梭入胞核[8]。多胺通过AMPK 调节的importinα1的磷酸化和乙酰化作用，调节ELAVL1 蛋白的亚细胞定位。多胺磷酸化激活细胞质中的AMPK，后者触发importinα 1 上105 位丝氨酸残基磷酸化，又可在辅助蛋白p300协助下，触发importinα1 上22 位赖氨酸残基乙酰化。活化的importinα1 与ELAVL1 蛋白结合，促进ELAVL1 蛋白进入细胞核[9]。AMPK 在3'-UTR 区域存在其他信号调节通路，提示ELAVL1 与AMPK 之间可能存在其他调控机制[10]。

ELAVL1 蛋白与靶mRNA 结合，从细胞核穿梭进入细胞质之后，通过磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等途径活化，稳定靶mRNA 结构，并促进相应蛋白的翻译，在疾病发展中起到一定作用[3]。如：在肺微血管内皮细胞中，细胞核内ELAVL1 蛋白受p38-MAPK 磷酸化作用，结合细胞间黏附因子-1（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1）并穿梭入胞质。胞质中精氨酸甲基转移酶-1 使ELAVL1蛋白217 位精氨酸残基甲基化，稳定ELAVL1 蛋白与ICAM-1 mRNA 的结合，促进ICAM-1 翻译。ICAM-1 介导中性粒细胞肺部浸润，是触发急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）的关键因素[11]。ELAVL1 的核质穿梭机制提示某些促进肿瘤进展的细胞因子的靶mRNA 可能与ELAVL1 稳定结合，进而导致肿瘤细胞内促癌因子在核质中异常分布，抑制ELAVL1 核穿梭可能是阻止肿瘤进展的潜在手段。

1 ELAVL1蛋白与肿瘤进展的关系

1.1 ELAVL1蛋白与肿瘤细胞增殖

ELAVL1 蛋白可以通过与一系列增殖相关靶mRNA 结合，并通过转录后调控，促使涉及编码细胞周期进程和细胞分裂的蛋白质的靶mRNA 表达升高，促进肿瘤细胞的增殖。

1.1.1 ELAVL1蛋白与雌激素受体（estrogen receptor,ER）雌激素受体是ELAVL1 蛋白直接结合靶点。ER 通过一系列信号传导途径促进肿瘤细胞增殖，如在乳腺癌中雌激素如雌二醇与配体结构域的结合，激活雌激素受体，导致雌激素受体二聚化，进一步与雌激素受体反应元件结合，启动位点的前增殖序列，促进肿瘤细胞增殖。多种细胞因子，如周期蛋白依赖激酶7（cyclin-dependent kinases 7,Cdk7）、表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等，可在雌激素受体的不同位点导致雌激素受体磷酸化，促进前增殖序列的激活[12]。ELAVL1 蛋白在乳腺癌细胞中表达与ER 阳性率呈正相关，并可以促进细胞肿瘤增殖能力。而地西他滨通过降低ELAVL1 蛋白的转录后调控水平来抑制ER 阳性乳腺癌细胞增殖能力[13]。目前研究发现，雌激素受体阳性的乳腺癌细胞中，人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2,ERBB2,formerly HER2）基因表达升高，ELAVL1蛋白调节可调控ERBB2的表达。细胞核中ELAVL1 蛋白与ERBB2 mRNA 3'-UTR 识别并结合，提高ERBB2的表达水平[14]。

1.1.2 ELAVL1蛋白与环氧合酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2）COX-2 负责前列腺素E2（Prostaglandin E2,PGE2）等前列腺素的生成[15],目前研究发现PGE2的异常高表达有促癌作用[16]。正常细胞中，COX-2仅分布于胃、肾、中枢神经系统以及女性生殖系统。肿瘤组织中，COX-2 活性明显增强[17]。COX-2 是ELAVL1 的直接结合靶点，ELAVL1 蛋白在细胞核中与COX-2 mRNA 3'-UTR 结合，稳定COX-2 mRNA 结构，使COX-2 转录水平提高[18]。COX-2 与ELAVL1蛋白显著相关，共同作用于肿瘤细胞增殖。COX-2可通过上调B 细胞淋巴瘤相关基因2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）抗凋亡；上调表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）进行肿瘤生长；通过与phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B（PI3K/AKT）的相互作用促进肿瘤组织炎症反应[19]。COX-2 与ELAVL1 蛋白结合后，可调控肿瘤细胞抗凋亡能力。目前发现该过程受半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）介导。细胞凋亡由内在或外在途径控制，内在途径由Bcl蛋白家族成员对线粒体膜电位的破坏触发。在外源途径中，细胞外死亡配体如Fas1 与细胞表面受体结合，刺激半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）裂解，随后激活Caspase-3，启动细胞凋亡。ELAVL1 与COX-2 mRNA 结合并稳定其结构，促进COX-2 转录，细胞内过表达的COX-2抑制Caspase-3 的活化，从而抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖[20]。ELAVL1蛋白在PKC 作用下发生磷酸化，实现核穿梭，敲除PKC 后，ELAVL1 蛋白核穿梭受抑制，COX-2 在细胞中表达降低[21]。另有研究发现，ELAVL1 蛋白通过稳定核内白细胞介素-18（Interleukin-18,IL-18）mRNA 3'-UTR，通过c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase JNK）实现核穿梭，使细胞内IL-18 表达水平上升。IL-18 进一步对COX-2 mRNA 转录后调控，促进细胞内COX-2 水平升高，COX-2 激活EGFR 促进肿瘤细胞的增殖[22]。因此，COX-2 与多种细胞因子相互作用，促进肿瘤增殖，ELAVL1 可放大COX-2 在肿瘤细胞增殖方面的生物学作用。

1.2 ELAVL1蛋白与肿瘤血管生成

血管生成是肿瘤细胞生长增殖转移侵袭的重要基础。肿瘤组织可分泌多种细胞因子，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor -A,VEGFA）、缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）等实现血管生成。近年来研究发现，ELAVL1 蛋白可与多种细胞因子相互作用，促进肿瘤血管生成。

1.2.1 ELAVL1 蛋白与VEGF-A血管内皮生长因子家族由VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E 组成。VEGF-A 促进血管生成受整合素ax 调控。整合素ax 诱导VEGR-A 与血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2）识别并结合，使VEGFR-2 自身酪氨酸残基磷酸化。活化的VEGFR-2 触发下游Src 同源区2（steroid receptor coactivator homology domain 2,SH2），包括细胞外信号调节激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2）、p38-MAPK 和PI3K/Akt，通过一系列级联反应，促进血管生成[23]。ELAVL1 蛋白与VEGF-A 存在显著关联，在模拟缺氧环境下，肿瘤细胞中ELAVL1 蛋白与VEGF-A 水平明显上调[24]。ELAVL1 蛋白通过与VEGF-A mRNA 3'-UTR结合，增加VEGF的表达，促进血管生成[25]。细胞中除了有ELAVL1 蛋白与VEGF-A 相互作用，还存在miR-200 与ELAVL1 竞争性抑制，两者处于动态平衡，平衡被打破时则血管形成过度，原因在于VEGF-A mRNA 3'-UTR 存在miR-200 结合位点，该位点与ELAVL1 结合位点重叠，当miR-200 结合时，可阻碍ELAVL1 蛋白与该位点的结合，进而抑制肿瘤血管的生成[26]。

1.2.2 ELAVL1 蛋白与HIF-1HIF-1 是两种由缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和HIF-1β 构成的异二聚体[27]。缺氧条件下，转化生长因子-1β（transforming growth factor-1β,TGF-1β）激活Smad 通路，激活的Smad3 蛋白促进HIF-1 水平升高，从而激活VEGF 转录，进而促进血管生成[28]。ELAVL1 蛋白与HIF-1 之间的功能联系，在常氧条件下，HIF-1α 在脯氨酰羟化酶作用下羟基化，HIF-1 活性下降。肿瘤细胞如果常处于缺氧环境中，则脯氨酰羟化酶活性下降，HIF-1 活性增强，暴露其mRNA 3'-UTR 上ELAVL1结合位点，ELAVL1 蛋白识别并结合后，稳定其结构，促使HIF-1 表达上调。HIF-1 与Smad3 协同作用促进血管生成[28]。上述研究发现，HIF-1 作为肿瘤血管生成的重要细胞因子，其在细胞内的表达水平可能受ELAVL1 转录后调控影响。ELAVL1 可能是促进肿瘤微环境中新生血管形成的重要分子。

1.3 ELAVL1蛋白与肿瘤侵袭、转移

肿瘤侵袭是指恶性肿瘤细胞从其起源部位向周围组织浸润的过程，其标志是肿瘤细胞突破基底膜。肿瘤转移是恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，形成与原发肿瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。ELAVL1 与多种细胞因子相互作用，影响肿瘤的侵袭与转移。

1.3.1 ELAVL1蛋白与Snail家族Snail 家族是一类锌指转录因子，包括Snail1、Snail2、Snail3。这3 种Snail 因子结合基因启动子序列，调节基因表达。Snail 在上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transformation,EMT）的调节中起关键作用，EMT 是上皮性肿瘤侵袭和转移的主要原因[29]。Snail 蛋白表达水平的升高会诱导EMT，并增强肿瘤细胞的体外迁移和侵袭以及体内转移[30-31]。ELAVL1 蛋白通过与Snail相互作用，促进肿瘤侵袭与转移，主要机制为：ELAVL1 蛋白识别并结合Snail mRNA 3'-UTR，稳定Snail mRNA，提高Snail 转录水平，促进Snail 合成，过表达的Snail 通过Snail-ETV7-SERPINE1 通路下调钙黏蛋白表达，促进EMT，导致肿瘤细胞侵袭性、转移性增强[32]。另外，极性蛋白Scribble 调控ELAVL1 蛋白与Snail 的相互作用。Scribble 是极性蛋白复合物的重要组成成分，定位在上皮细胞顶端。多种恶性肿瘤中，Scribble 过表达促进肿瘤细胞侵袭与转移。一方面，ELAVL1 通过与Snail mRNA3'-UTR 结合促进Snail 转录水平提高，另一方面，ELAVL1 蛋白与Scribble mRNA3'-UTR 识别并结合，Scribble 转录增加，作为p38-MAPK 通路激动剂，促进ELAVL1 核穿梭，间接促进Snail 的转录水平，加速EMT进程[33]。

1.3.2 ELAVL1 蛋白与基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9,MMP-9）基质金属蛋白酶家族（matrix metalloproteinases,MMPs）是一类依赖锌的内肽酶，具有20 多个不同的成员，其中，MMP-9 因其可降解细胞外基质，在肿瘤转移侵袭方面起重要作用[34]。在乳腺癌细胞与骨肉瘤细胞中已证实ELAVL1与MMP-9 存在相互作用[35-36]。ELAVL1 蛋白通过与MMP-9 mRNA3'-UTR 结合，在胞质中MMP-9表达升高，细胞外基质降解增多，肿瘤细胞侵袭性与转移性显著提升[37]。肿瘤的转移与侵袭是目前治疗肿瘤的一大难点，ELAVL1 与Snail 家族和MMP-9 之间的相互作用关系提示ELAVL1 在肿瘤转移与侵袭方面可能发挥重要作用。

1.4 ELAVL1蛋白与肿瘤耐药性

肿瘤多重耐药（multidrug resistant,MDR）是导致肿瘤治疗失败的主要原因之一，ELAVL1 蛋白与肿瘤耐药性可能存在关联[38]。ELAVL1 蛋白通过转录后调节三磷酸腺苷结合盒（adenosine triphosphate binding cassette,ABC）转运蛋白家族的蛋白质直接促进耐药性。该过程中，ELAVL1在蛋白在靶mRNA 的翻译的调节中可能起重要作用。ELAVL1 蛋白结合在内部核糖体进入位点（internal ribosomal entry site,IRES），通过PKC 磷酸化的方式，完成核穿梭，上调Caspase-2 的翻译。高表达的Caspase-2 增强肿瘤细胞抗凋亡能力，降低对抗肿瘤药物的敏感性[39]。细胞相关蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein）是一种ATP依赖性膜转运蛋白，属于ABC 转运蛋白家族成员。P-糖蛋白不仅可以通过泵作用机制将细胞内的化疗药转运至细胞外，而且可以通过与细胞内化疗药物形成耦合物使细胞内化疗药物浓度再分布，最终形成肿瘤耐药[40]。研究发现，ELAVL1 可与MiR-19b 结合，该复合物稳定P-糖蛋白mRNA 结构，并激活p38/MAPK 通路完成核穿梭，导致P-糖蛋白高表达，最终引发肿瘤耐药[41]。另外，原癌基因PIM1（Pim-1 Proto-Oncogene），一种丝氨酸-苏氨酸激酶，调控头颈鳞状细胞癌、前列腺癌以及胰腺导管细胞癌的耐药性。PIM1 通过磷酸化和灭活关键的凋亡因子和肿瘤抑制蛋白驱动耐药性，ELAVL1 蛋白可结合PIM1 mRNA3'-UTR，从而稳定其结构，提高转录水平，增强肿瘤耐药性[42]。在目前研究中发现，长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）如lncRNANR2F1-AS1、lncRNA-HANR、lncRNA-MALAT1 等与肿瘤耐药性相关[43]。目前发现ELAVL1 与lncRNA 之间存在相互作用，lncRNA-FENDRR 可与多耐药基因1（multidrug resistance 1,MDR1）mRNA3'-UTR 区结合，促进肿瘤细胞对化疗药物敏感，并加速肿瘤细胞凋亡。ELAVL1 与lncRNA-FENDRR 竞争性结合MDR1 mRNA3'-UTR，下调lncRNA-FENDRR 抑制肿瘤耐药的作用，导致MDR1基因过表达，最终增强肿瘤耐药性[44]。目前研究提示，ELAVL1 与肿瘤耐药性之间可能存在相应关系，但具体机制尚不明确，研究ELAVL1 与导致肿瘤耐药相关基因的相互作用可能是未来研究肿瘤耐药机制的新方向。

2 结语

RNA 结合蛋白ELAVL1 是一种核质穿梭蛋白，在多种细胞因子作用下，通过多种主要的信号通路完成核穿梭，从而稳定靶mRNA 的结构。ELAVL1通过转录后调控，控制结合的特定mRNA 的表达水平以及亚细胞定位。目前研究发现，ELAVL1 与多种细胞因子相互作用，在肿瘤细胞增殖、转移、血管生成及耐药性方面存在一定关联，说明ELAVL1 可能是促进肿瘤进展的一个潜在的重要因子。因此，抑制ELAVL1 核穿梭，降低其在细胞质内的富集、阻断ELAVL1 与相关靶基因mRNA 的结合、降低ELAVL1与相关靶基因mRNA 形成的耦合物的稳定性或许是未来治疗肿瘤的一个方向。通过ELAVL1 与肿瘤耐药性关系的深入研究发现，ELAVL1 可与miRNA、lncRNA 相互作用，共同影响肿瘤细胞的耐药性，具体的相互作用及激活的信号通路机制尚不明晰，这也是日后亟需解决的问题之一。另外，ELAV 家族还包括Human antigen B（HuB）、Human antigen C（HuC）、Human antigen D（HuD），这3 种蛋白与ELAVL1 之间相互作用目前尚不明确，目前ELAVL1 的相关研究也为ELAV 家族其他蛋白的研究提供了一定的帮助。