铁死亡通路与心血管疾病的研究进展

吕明明 ，郑在勇 ，张玉龙 ，岳荣川 ，胡厚祥 *

铁死亡是由DIXON等［1］在2012年首次描述的一种铁依赖的新型细胞死亡形式，这种死亡是通过抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运体（System Xc-）引起的。铁死亡在形态学、生化和遗传学上均与细胞凋亡、坏死和自噬不同，主要特征是大量的铁离子依赖性脂质过氧化物累积。其在形态学上的显著特征主要表现在线粒体上，如线粒体体积变小、膜密度增加和嵴缺失［1］。就机制而言，谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）介导的氧化还原平衡紊乱是铁死亡的一个独有的特征［2］。研究证明铁死亡在肿瘤［3］、神经退行性病变［4］、肾衰竭［5］以及心血管疾病［6-9］中均发挥着重要作用。对铁死亡认识的深入，将进一步理解相关疾病的发生、发展机制，为相关疾病的预防和治疗提供全新的思路与策略。

1 铁死亡的调控机制

1.1 铁代谢 铁死亡的执行及脂质过氧化物的累积均需要铁。细胞内的Fe2+通过芬顿反应生成Fe3+，从而增加活性氧并激活脂氧合酶（LOX），导致组成生物膜的多不饱和脂肪酸（PUFAs）发生脂质过氧化，进而破坏细胞膜［10］。因此，铁的运输、储存与利用均会影响细胞对铁死亡的敏感性，而铁蛋白在铁代谢的调节中起着重要作用。铁蛋白是由24条重链和轻链构成的球形杂聚蛋白，而铁蛋白重链（Fth）具有亚铁氧化酶活性，能将Fe2+氧化为Fe3+，并储存在铁蛋白的球状空心结构内［11-12］。在细胞内，核受体共激活因子4（NCOA4）能将铁蛋白运输到自噬体中，并进行溶酶体降解和释放游离铁，从而提高细胞对铁死亡的敏感性［13-15］。而BROWN等［16］研究者发现Prominin2（一种5跨膜糖蛋白）能促进含有铁蛋白的多泡小体（MVBs）和外泌体（EXO）的形成，并将铁从细胞中运输出去，从而抑制铁死亡。

血红素加氧酶（Hmox1）在铁代谢的调节中也起着重要作用。人体每天需要的铁，绝大部分来源于衰老的红细胞被巨噬细胞吞噬再循环的铁，主要是血红素分解产生的铁。而Hmox1是血红素分解代谢过程中的限速酶，可以分解血红素为一氧化碳、Fe2+和胆绿素［17］；Hmox1介导血红素中铁离子释放诱导的铁死亡，是阿霉素诱导小鼠心脏毒性的罪魁祸首［6］。因此，铁代谢的调节是控制铁死亡的一个重要因素。

1.2 脂质过氧化 脂质过氧化是铁死亡的特征之一。在铁死亡中，GPX4是一种重要的抗氧化酶，利用GSH作为底物来减少和防止脂质活性氧（ROS）的积累，从而保护细胞免受氧化应激和脂质过氧化［2］。GSH由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。通过阻止半胱氨酸摄取来抑制GSH合成或直接抑制GPX4均会导致铁介导的脂质过氧化产物的形成和积累，如Erastin、RSL3［18］。Erastin可通过抑制System Xc-来减少细胞内的半胱氨酸及GSH，进而抑制GPX4清除ROS导致铁死亡［1］。System Xc-是由跨膜转运蛋白SLC7A11和跨膜调节蛋白SLC3A2组成的一种跨膜氨基酸转运体，能在摄取一分子胱氨酸的同时排出一分子谷氨酸［19］；其摄入的胱氨酸在细胞中被还原为半胱氨酸，参与GSH的合成。由于谷氨酸被System Xc-以1∶1的比例交换成胱氨酸，使细胞外高浓度谷氨酸也能通过抑制System Xc-而诱导铁死亡，这也许可以解释谷氨酸在神经系统中积聚到高浓度时的毒性作用［1］。有研究显示，在Fth基因敲除小鼠的心肌细胞中过表达SLC7A11，可恢复其心肌组织中胱氨酸和GSH的水平，并抑制铁死亡［7］。RSL3是通过直接抑制GPX4的活性，使细胞的氧化还原平衡向ROS积累、氧化应激和铁死亡转变［20］；Gpx4基因敲除会上调对RSL诱导的铁死亡敏感性，而过表达GPX4会增加细胞对铁死亡的抵抗［21］。

脂质代谢与细胞对铁死亡的敏感性密切相关。多不饱和脂肪酸易受脂质过氧化影响，是发生铁死亡的必要条件。因此，多不饱和脂肪酸的浓度和定位决定了细胞内脂质过氧化的程度和发生铁死亡的可能性，补充花生四烯酸或其他多不饱和脂肪酸会使细胞对铁死亡敏感［10］。脂氧合酶是不饱和脂肪酸代谢的关键酶类，可将花生四烯酸、亚油酸及其他不饱和脂肪酸转变为有生物活性的代谢产物。事实上，通过抑制脂氧合酶可以抑制RSL3诱导的铁死亡，而抑制环氧合酶（COX）或细胞色素450（CYP450）则没有相同的效果［22］。最新研究显示，表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS）/NO的M1型巨噬细胞和小胶质细胞对铁死亡有很高的抵抗力，而其保护机制与15-脂氧合酶（15-LOX）有关［23］。另外，一项对不同饱和水平和链长的脂肪酸研究发现，双键的位置也是诱导铁死亡的关键［24］。游离多不饱和脂肪酸是合成脂质信号递质的底物，但其必须被酯化为膜磷脂，并经过氧化才能转化为诱导铁死亡的有效信号［22］。脂质组学研究表明，包含花生四烯酸的磷脂酰乙醇胺（PEs）是关键的磷脂，其会发生氧化并促使细胞发生铁死亡［2，22，24］。长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）和溶血卵磷脂酰基转移酶3（LPCAT3）分别参与细胞膜中多不饱和脂肪酸PEs的生物合成和重塑，ACSL4和LPCAT3基因缺失的细胞对铁死亡的抵抗均显著增加［22，24］。参与磷脂代谢的酶被认为是铁死亡的重要因素，进一步证实磷脂参与铁死亡。在正常条件下，GPX4可还原上述过程产生的磷脂氢过氧化物。OLZMANN研究组发现，铁死亡抑制蛋白1（FSP1），以前称为线粒体凋亡诱导因子2（AIFM2），能独立于经典的GPX4信号通路抑制细胞铁死亡，即FSP1通过豆蔻酰化被募集到质膜上，在质膜上FSP1通过还原辅酶Q（CoQ10）来阻止脂质过氧化，进而抑制铁死亡。这是迄今为止，首次发现能够补偿GPX4缺失的酶催化系统［25］。

1.3 其他 上述研究体现了铁死亡的发生和执行是由铁代谢、氨基酸和脂质代谢共同调控的，但还有一些特殊途径可影响细胞对铁死亡的敏感性。例如能量应激（energy stress），是一种代谢应激类型，其特征是细胞内ATP的消耗和相应的AMP水平的升高，也能抑制细胞铁死亡［26］。该研究证明，能量应激通过激活AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）抑制铁死亡，而AMPK至少部分通过磷酸化并失活乙酰辅酶A羧化酶（ACC）来抑制PUFAs和其他脂肪酸的生物合成，从而抑制铁死亡。另外，衰老细胞对Erastin和RSL3诱导的铁死亡均具有很高的抵抗性，并且在抗ROS抑制细胞衰老的同时，会增加衰老细胞对铁死亡的敏感性［27-28］。有趣的是，衰老细胞在增加转铁蛋白受体1（TfR1）和铁蛋白同时，减少了细胞膜上的膜铁转运蛋白l（FPN1）。因此，衰老细胞通过增强对铁的吸收和储存积累了大量铁（高达20倍）。而衰老细胞中的这种铁积累又与自噬/溶酶体功能障碍有关，因为铁蛋白通过自噬途径降解［29］。但在铁过载的情况下，衰老细胞对铁死亡抵抗的机制尚待进一步研究。

2 铁死亡在心血管疾病中的作用研究

目前，中国心血管疾病死亡居于城乡居民总死亡原因的首位，且心血管疾病患病率总体上仍处于持续上升阶段，进一步加强心血管疾病的防治显得尤为重要［30］。心肌细胞作为一种高度分化的终末细胞，一般不能分裂增殖，其死亡将导致心肌细胞数量的减少，从而导致心脏结构和功能的改变。因此，抑制心肌细胞死亡是保护心脏功能、防治心脏疾病的关键。在细胞死亡的多种形式中，心脏中观察到的主要是凋亡、坏死性凋亡、坏死、焦亡、自噬和铁死亡六种［31］。

临床研究表明，ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者经皮再灌注治疗后的磁共振成像显示梗死区铁含量升高，且梗死区的心肌铁是心肌梗死后左心室重构的危险因素［32］。这成为研究心脏中铁死亡的一个强有力的理论基础。但在一项更早的随机对照试验中，研究者发现在经皮再灌注治疗前给STEMI患者静脉注射铁螯合剂去铁胺，并不影响患者的左心室收缩功能与心肌梗死面积，这可能与去铁胺给药是在缺血开始后以及其到达缺血心肌时没有足够的浓度等因素有关［33］。蛋白质组定量分析也显示，GPX4在小鼠心肌梗死过程中的早期和中期明显下调，通过RNA-seq和qRT-PCR分析表明GPX4的下调发生在转录水平。然而，其他GPX家族成员的mRNA表达水平增加，这表明GPX4是心肌梗死期间GPX家族成员中一种被特异性下调的蛋白质［34］。而GAO等［8］通过建立离体的小鼠心脏缺血再灌注（I/R）模型，发现通过使用去铁胺和抑制谷氨酰胺代谢进而抑制铁死亡，可以减轻再灌注损伤。在BABA等［35］的研究中，雷帕霉素（mTOR）能够抑制小鼠心肌细胞在I/R损伤时发生的铁死亡，部分原因可能是mTOR抑制ROS的产生，但具体机制尚不清楚。因此，解读mTOR通路在铁死亡中的作用可能为心肌梗死患者提供一种新的治疗策略。另外，LI等［36］使用fer-1（一种铁死亡抑制剂）可以减少心脏移植和心肌I/R模型的心肌细胞死亡，并改善I/R模型的左心室收缩功能和心室重构；利用心脏移植的活体成像，发现细胞铁死亡过程中释放的内容物，能通过TLR4/Trif/Type 1 IFN途径促进中性粒细胞与冠状动脉血管内皮细胞黏附，从而将中性粒细胞募集到受伤的心肌。因此，在移植前使用铁死亡抑制剂有望改善心脏移植后的缺血损伤。

FANG等［6］及其团队在国际上率先揭示靶向铁死亡是防控心脏疾病有效措施，该研究团队在阿霉素诱导的小鼠心肌病模型中，通过RNA测序分析来确定治疗组和对照组小鼠心脏中差异表达的基因，发现Hmox1显著上调；进一步揭示，阿霉素是通过Nrf2来介导Hmox1的上调，而Hmox1的激活介导血红素中铁离子的释放，随后心肌细胞由于铁超载而诱发铁死亡，最终导致心力衰竭。使用fer-1和铁螯合剂右丙亚胺可显著减轻阿霉素导致的小鼠心脏损伤和心力衰竭，并提高其存活率。这是首次从在体水平得出心脏细胞死亡和铁超载诱导的铁死亡之间的联系，并提示铁死亡可作为心脏疾病治疗的新靶点。另外，研究还发现在心肌细胞Fth基因敲除的小鼠中，ROS的产生会增加，并增加对铁超载相关的铁死亡和心肌病的易感性［7］。铁死亡抑制剂fer-1能够有效抑制心肌细胞中与心力衰竭相关基因的表达，从而减轻小鼠的心室肥厚及心肌损伤［7］。这表明，铁蛋白Fth在预防心脏铁死亡和心力衰竭方面也有着重要作用。除此之外，在压力超负荷诱导的大鼠心力衰竭模型中，铁死亡抑制因子GPX4和Fth1的表达明显下调，而敲除TLR4或NOX4基因可以恢复心肌细胞GPX4和Fth1的表达水平，并改善心力衰竭大鼠的心室重构及左心室功能［37］。因此，通过靶向TLR4-NOX4通路而抑制铁死亡的药物，有望作为一种新的抗心力衰竭治疗手段。但需要注意的是，铁缺乏症也是心力衰竭最常见的合并症之一，且与性别、种族、贫血和左心室射血分数等因素无关［38］。目前，人类心力衰竭中导致铁缺乏症的相关机制尚不清楚。一个可能机制是，过量的儿茶酚胺和醛固酮下调转铁蛋白受体的表达，导致心肌细胞铁摄取减少［39］。对于伴有铁缺乏症的心力衰竭患者，静脉补充铁剂有助于改善其活动耐力和生活质量，这在国内外最新的心力衰竭指南中均已明确指出［40-41］。从铁超载到铁缺乏，可见铁在心力衰竭的病理生理及治疗上均扮演着极其重要的角色。

中药在我国已有几千年的使用历史，近来的研究显示中药及其活性成分对铁死亡也具有调节作用。在通过结扎大鼠降主动脉诱导的心力衰竭模型中，LIU等［42］发现葛根素（一种异黄酮类化合物）能有效减少心肌细胞的死亡，且能显著抑制大鼠体内的脂质过氧化反应，在用Erastin或异丙肾上腺素处理的心肌细胞中，葛根素能恢复心肌细胞活力，并降低不稳定铁池和脂质过氧化产物。以上结果表明葛根素能通过抑制铁死亡减少心肌细胞的死亡。目前，对心肌铁死亡的治疗性研究中，中药及其相关作用的研究还较少。因此，进一步明确中药在抗铁死亡中的作用及机制，可为心血管疾病的治疗提供新思路。

3 结语

铁死亡作为一种新型细胞死亡形式，自2012年被发现以来，在确定铁死亡的分子调控方面已取得迅速进展。但作为一种由多种物质共同调控的死亡形式，哪些是铁死亡过程中最关键的执行分子仍不清楚。铁死亡已被证明在心脏疾病中发挥了重要作用，但目前有关铁死亡与心血管疾病之间的研究仍较少，且主要集中在心肌梗死、缺血再灌注损伤和抗肿瘤药物所致心脏损伤等方面。进一步探讨铁死亡的机制及其在心血管疾病中作用，可为靶向铁死亡作为心脏疾病防治提供更多的科学依据。总之，铁死亡研究方兴未艾，是心血管疾病防治领域富有前景的一个新方向。未来还有待于探究：（1）铁死亡究竟是如何导致细胞死亡的？（2）生理过程中是否存在铁死亡及其意义如何？（3）铁死亡在心血管疾病中的具体机制以及将其作为心血管疾病防治靶点的疗效如何？

作者贡献：吕明明、郑在勇进行资料收集及整理，撰写论文；张玉龙、岳荣川进行论文的修订，负责文章的质量控制及审校；胡厚祥对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。