整合素αVβ3参与骨肉瘤发生进展机制的研究进展*

许中华，王 敏 综述，张 瑗 审校

(陆军军医大学第二附属医院骨科，重庆 400038)

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发性骨肿瘤，占所有恶性原发性骨肿瘤的20%～35%[1]，最常见的病变部位为生长活跃的股骨远端、胫骨近端的干骺端，常伴有侵袭性和高度的局部复发和远处转移。10%～20%的患者在诊断时可检测到已经转移，而30%的无转移骨肉瘤患者及80%在初诊即合并转移的患者会出现复发[2]，因此骨肉瘤也是转移和复发率最高的肉瘤之一，临床治疗挑战极大。20世纪70年代以前，截肢手术是该肿瘤的标准治疗方法，结果显示5年生存率为10%～20%；大多数患者在术后1年内出现局部复发或肺部转移[1]。从20世纪70年代开始，化学药物联合广泛的手术边缘切除等多学科方法显著提高总生存率至60%～70%，保肢率达到90%～95%[2-3]。

尽管如此，骨肉瘤患者的生存率在过去40年里并未比其他实体瘤有质的飞跃。表现在近40年来骨肉瘤的治疗方案、手术技术并未发生革命性进步。究其原因，(1)骨肉瘤属于低发病率肿瘤，在全球范围内受到系统研究力度偏低，特别是分子机制研究仍较薄弱;(2)骨肉瘤属于高级别肉瘤，肿瘤异质性特征非常明显，本身就有成骨、成软骨、成纤维细胞型肿瘤等组织来源分型；可分为经典型、毛细血管扩张型、皮质旁型、小细胞型等病理分型；(3)骨肉瘤的间质成分远高于其他实体瘤，肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)更加复杂，细胞间作用极其微妙，易导致免疫逃避和豁免，乃至发生化疗抵抗和复发转移[4]。

因此，在临床进展缓慢的前提下，从分子水平上揭示骨肉瘤的发生发展和转移机制，将利于采用新的治疗理念和策略来改善骨肉瘤患者的预后，这也成为当前肿瘤领域一个具有挑战性的科学问题。分子遗传学研究发现，骨肉瘤的发生、发展表现出染色体不稳定/破裂、原癌基因的激活、抑癌基因失活等特征[5]。此外，某些微小RNA也参与骨肉瘤基因的转录后调控，如Ras、Wnt、Notch等[6]。另外，高通量基因组测序发现较高的突变负荷,如BOUSQUET等[7]发现CDK4、MDM2等26个原癌基因和p53、Rb等27个抑癌基因属于有效突变。这些发现也得到体外实验证实，如有研究发现44%的骨肉瘤标本存在PTEN的表达异常，PTEN基因下调可以增加PIP3去磷酸化，逆转PIP3向PIP2的转化，增强肿瘤的侵袭能力[8]。另外PD-1/PD-L1轴与患者预后和总体生存率呈负相关，且PD-1单抗nivolumab可以抑制小鼠骨肉瘤细胞的肺转移[9]。

最新的研究进展亦显示，一种位于细胞表面的跨膜蛋白整合素(integrin)，参与了骨肉瘤TME中的形成过程。TME是由肿瘤组织癌巢中的细胞成分和非细胞成分构成，对顽固性恶性疾病的进展发挥了重要作用，具体包括：细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、肌纤维母细胞、成纤维细胞、神经内分泌细胞、脂肪细胞、免疫炎症性细胞、淋巴血管网络和整合素家族[10]。整合素作为TME的生物力学传感器，通过在涉及感知和重塑细胞微环境的多种情况下发挥调节作用进而促进肿瘤发生、发展[11]。因此，TME正日益被认为是疾病发展多阶段的关键因素，特别是局部耐药、免疫逃逸和远处转移，从而对临床肿瘤一线干预的未来发展产生重大影响。

1 整合素概述

整合素是由非共价结合的α和β亚单位组成的异二聚体。在哺乳动物中，有18个α和8个β亚单位可以组装成24种不同的受体，不同的整合素亚型具有不同的结合形式和组织分布特点，如整合素αⅡbβ3局限于血小板；整合素α6β4局限于角质形成细胞；整合素αEβ7局限于黏膜组织中的T细胞、树突状细胞和肥大细胞；整合素α4β1局限于白细胞；整合素α4β7局限于记忆性T细胞亚群；整合素αvβ6的表达仅限于上皮细胞。而整合素αVβ3广泛分布于内皮细胞；整合素α5β1和αvβ3在骨祖细胞和成骨细胞内表达上调，并与成骨细胞的增殖、成骨分化和基质矿化关系密切[12]。整合素作用几乎涉及机体所有的生理过程，例如其通过细胞黏附这一作用在血小板凝集、创伤愈合、白细胞游出及机体发育等过程中发挥关键作用。

整合素能够结合细胞外基质中的成分，并调控细胞骨架构成，从而对细胞的生存、增殖、黏附和迁移起到严格的控制。如在黑色素瘤从自由基生长期(radical growth phase，RGP)转化为垂直生长期(vertical growth phase，VGP)时，许多整合素表达水平会发生变化。例如，与RGP比较，VGP中许多原发性和转移性黑色素瘤细胞中的整合素αvβ1和αvβ3上调，这种上调与黑色素瘤转移的发展呈正相关，同时黑色素瘤细胞对整合素αvβ3的过度表达也被发现在黑色素瘤从非致瘤性RGP转化为具有致瘤性和侵袭性的VGP中起着重要作用[13]。此外，整合素还决定转移部位的定殖，促进循环肿瘤细胞的锚定非依赖性存活。整合素介导的肿瘤间质的感知、硬化和重塑是支持侵袭、获得肿瘤干细胞特征和耐药性癌症进展的关键步骤[14]。如整合素αvβ3与多种趋化因子(如 CXCL12、IL8)、炎症因子(如 TNF、COX)、生长因子(如 IGF、TGF)等密切关联，被认为是前列腺癌和乳腺癌侵袭和转移的重要机制[15]。

2 整合素αvβ3的生物学特性

整合素αvβ3是由αv和β3亚基组成的大型跨膜异二聚体蛋白，通过识别骨桥蛋白、玻连蛋白和纤维连接蛋白等配体中保守的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序介导细胞与细胞外基质(ECM)的黏附[16]。整合素是一类有“由内而外”和“由外向内”两种信号传递方式的双向信号分子。整合素激活主要由β亚基发生构象变化而实现，在“由内而外”的信号传递过程中，β3亚单位的短胞质尾通过与talin和kindlin结合，将整合素与肌动蛋白细胞骨架相连，引起构象变化，以高亲和力结合的形式重组整合素，从而增加αvβ3对细胞外配体的亲和力[17]。整合素与细胞骨架结合后，可以协调细胞迁移与ECM的相互作用、抑制促凋亡蛋白的存活信号，ECM还能释放出若干驱动细胞周期的生长因子，同时整合素αvβ3的信号传导还可与多种生长因子受体如EGF受体(EGFR)和TGF-β受体(TGFBR)等协同作用，也可与下游通路(如TGFBRII)直接相互作用[18]。另外研究表明，整合素αvβ3在破骨细胞介导的骨吸收、血管生成和凋亡细胞的吞噬过程中起着重要作用[16]。

3 整合素αvβ3参与骨肉瘤发生发展的可能机制

3.1 整合素αvβ3在骨肉瘤中异常表达

研究显示：整合素αvβ3在骨肉瘤中呈过度表达，其在肿瘤血管内皮细胞中表达上调尤为明显[19]，多项研究发现整合素αvβ3表达的改变与骨肉瘤发生转移有关，可以作为骨肉瘤转移潜能的指标[19]。例如，有研究评估了整合素αvβ3在人骨肉瘤143B细胞系子细胞LM1-LM4中的表达，该子细胞转移潜力增大。在裸鼠胫骨原位移植时，LM1-LM4的转移率比143B母系细胞高18倍，而整合素αvβ3的表达水平高6倍[19]。另外在亲代SAOS细胞系中发现了使其肺转移潜力增加的LM2-LM7子细胞，并观察到整合素αvβ3表达与转移率直接相关。与亲代非转移性SAOS细胞比较，LM2-LM7细胞对肺组织的趋化活性更强，并且在肺组织中的迁移能力比在其他脏器内皮细胞中的特异性更强[19]，并且在肺组织中的迁移能力，这种情况与临床上骨肉瘤转移几乎只发生在肺部的情况相符合，亦能解释骨肉瘤患者早期肺转移这一临床特征。

有研究评估了整全素αvβ3在趋化和凋亡过程中发挥作用的各种途径之间的相互作用。例如，整合素αvβ3与组织抑制物金属蛋白酶-1 (TIMP-1)的相互作用可使MG-63 人骨肉瘤细胞抵抗肿瘤坏死因子-α (TNF-α)诱导的凋亡。在骨肉瘤特定环境下，用TNF-α干预MG-63细胞导致TIMP-1分泌增加5倍，且整合素αvβ3上调，这与凋亡抵抗有关[16]。此外，整合素αvβ3还可以与其他因素共同表达。整合素αvβ3与FN共同表达形成的FN-αvβ3轴通过上调整合素连接激酶(integrin linked kinase，ILK)的活性来促进肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移。

3.2 整合素αvβ3参与肿瘤血管生成

血管生成在肿瘤的生长和转移中起着重要作用，整合素αvβ3在肿瘤血管生成中发挥了核心作用。整合素表达在血管内皮细胞的有腔面和无腔面,介导内皮细胞的迁移和毛细血管管腔的形成，而血管生成依赖生长因子和黏附分子的相互作用，生长因子传导的信号使细胞连接到ECM并促进有丝分裂是大多数正常细胞增殖所必需的，这提示整合素和生长因子信号通路在某些位点相遇。整合素αvβ3在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 的刺激下表达上升,提示FGF 可能是通过上调整合素αvβ3来促进血管生成；整合素αvβ3能与多种含有RGD序列的配体分子结合,引导血管内皮细胞侵入ECM而发挥促进血管生成的作用；整合素αvβ3通过结合和激活新血管迁移端的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)，破坏ECM，促进血管生成，进而增强其迁移和浸润能力[20]。临床研究表明，使用抗体或低分子量拮抗剂靶向整合素αvβ3功能可抑制多种模型中的血管生成，包括肿瘤血管和氧化性视网膜病变中的新生血管[21]。

3.3 整合素αvβ3具有“原癌”特征

通常认为整合素与细胞骨架重组和黏附斑形成有关，但在许多病理变化中整合素也表现出其他异常的功能。例如，尽管整合素本身与细胞恶性转化无关，但他与多种肿瘤蛋白，如SRC家族激酶、黏附斑激酶FAK、酪氨酸激酶受体等联系密切，在肿瘤的发病机制中可能具有更重要的意义，被称为原癌整合素(pro-oncogenic integrins)。例如表达整合素αvβ3的肿瘤细胞，从细胞外基质中分离出来，能在体外以非锚定方式增强肿瘤细胞生长，并以独立于FAK激活的机制促进肿瘤细胞存活。另外整合素αvβ3激活使下游丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酸肌醇激酶(PI3K)/Akt和细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化进而调节细胞增殖、迁移、侵袭和细胞存活。这些发现揭示了整合素αvβ3在锚定非依赖性肿瘤细胞生长和侵袭性中的“原癌”特征[22]。课题组对学科积累的骨肉瘤标本进行了组织染色分析和基因蛋白表达检测，发现不同级别骨肉瘤细胞表面整合素的表达具有不同特征。

3.4 整合素αvβ3调控TME的相互作用

研究提示，整合素αvβ3协调并参与了骨肉瘤TME中相关细胞如巨噬细胞、成纤维细胞及破骨细胞的分化和凋亡。例如，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是机体单核细胞前体在特定条件下从体液循环迁移至TME内，在重构的ECM蛋白和肿瘤干细胞特定刺激下发生了结构和功能改变的一类巨噬细胞。巨噬细胞前体在IFN-γ或LPS的刺激下可分化为具有抗肿瘤特征的TAM(M1型)。而在如IL-4、IL-13、寄生虫感染等特定情况下，M1型TAM会向致瘤效应的M2型分化。TAM功能失调，特别是M1/M2极化失稳是骨肉瘤侵袭、转移的重要特征[23]。

成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。肿瘤相关成纤维细胞 (cancer associated fibroblasts，CAFs) 作为TME中的主要细胞类型，其生物学特性具有来源、表型和功能异质性，通过产生和分泌各种趋化因子促进上皮间充质转化，CAFs可介导肿瘤干细胞支持肿瘤生成、增殖、侵袭和转移。此外CAFs可促进SDF-1、TGF-β1、IL-6和MMP-9的分泌，以促进癌细胞的脱离和侵袭[24]。在体外细胞模型中，成纤维细胞的多种细胞外基质成分，可招募特定的整合素受体，如整合素αvβ3可以维持cEDS、vEDS、hEDS、HSD和ATS等真皮成纤维细胞的细胞黏附能力，促进肿瘤细胞分裂增殖[18]。

破骨细胞是骨肉瘤TME中的另一种具有组织特异性的单核巨噬细胞，有别于TAM的肿瘤炎症和免疫功能，骨肉瘤微环境中的破骨细胞存在高效集中、增殖、分化、激活的特点，肿瘤特异性整合素αvβ3促进骨溶解的分子机制仍在探索中，但研究表明，整合素αvβ3信号传导导致转录因子 Runx2上调了基质金属蛋白酶(如MMP-9，MMP-13)的表达。另外整合素αvβ3可增强TGF-β信号表达，该信号已被证明可刺激肿瘤细胞PTHrP的表达和RANKL在成骨细胞表达，从而促进破骨细胞介导的骨破坏[16]。

4 基于整合素αvβ3的靶向治疗进展

整合素αvβ3在高度恶性的骨肉瘤中特异表达提示其可能是骨肉瘤的一个有前景的治疗靶点。

4.1 整合素αvβ3的单克隆抗体或拮抗剂抑制整合素的功能

整合素αvβ3抗体对体外培养的MG-63人骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力有明显的抑制作用，其作用表现出明显的量效关系。DEMIRCIOGLU等[21]在一项调查研究中提到，CNTO 95是一种整合素αvβ3特异性的人源性单克隆抗体，在体外和体内均可抑制肿瘤生长和血管生成，而整合素αvβ3的人源性单克隆抗体LM609(Vitaxin)对肿瘤生长有明显抑制作用。TOME等[25]使用环RGD肽拮抗剂echistatin对高转移的LM1-LM4细胞系进行了体外分子靶向药物测试，结果提示该拮抗剂显著降低LM1-LM4细胞系在体外的增殖、迁移、侵袭和黏附能力。ALDAY-PAREJO等[26]报道整合素αvβ3和αvβ5双重拮抗剂 SCH221153能有效地抑制血管生成和肿瘤生长，对皮内注射或皮下注射人黑色素瘤LOX细胞诱导的严重联合免疫缺陷小鼠的肿瘤生长具有显著的抑制作用。

4.2 整合素αvβ3介导的基因治疗

以整合素为靶点,通过基因传递影响血管生物学，诱导内皮细胞大量凋亡,有望成为抗肿瘤血管生成的新战场。有研究用阳离子纳米粒子(NP)与整合素αvβ3靶向配体结合形成一种小颗粒复合物(αvβ3-NP)，该复合物能选择性地与整合素αvβ3受体结合并抑制突变的Raf基因，阻断内皮细胞信号传导和血管生成，动物实验中，向小鼠体内注射αvβ3-NP复合物，可导致肿瘤相关内皮细胞凋亡，最终导致肿瘤细胞凋亡和已建立的原发性和转移性肿瘤的持续消退[27]。

4.3 整合素αvβ3介导的适配体(aptamer)

适配体是一种单链核苷酸制备的分子探针，具有灵活的三维构型，以高亲和力和高度特异性的方式识别和结合其同源靶点，包括肿瘤表面受体整合素αvβ3、αvβ1等。由于其独特的内在特性，许多适配体可以与骨肉瘤关键基因特异性结合以定向地将抗癌药物转移到肿瘤部位，以减少系统的细胞毒性，并增强这些杀瘤剂的渗透性进而达到抑制肿瘤基因转录和表达的目的[24]。

4.4 整合素αvβ3介导的其他治疗

本课题组研究探讨了一种新型重组蛋白修饰的仿生陶瓷界面对表面参数和细胞行为的影响。将设计制备的重组纤维连接蛋白/钙粘蛋白复合脂(rFN/CDH)重组蛋白和重组纤维连接蛋白/钙粘蛋白-紫杉醇复合体(rFN/CDH-PTX)纳米颗粒通过层层自组装技术嫁接在双向磷酸钙(BCP)表面，发现该界面可以与整合素α5β1和αvβ3特异性结合，高效诱导间充质干细胞MSC的黏附和骨肉瘤细胞的定向募集，且与界面成骨细胞和骨肿瘤细胞特异性表达的整合素高度相关，这些结果表明rFN/CDH具有诱导BCP表面增强黏附、增殖和骨化的功能，有望成为一种有前途的组织工程支架材料用于肿瘤型骨缺损的修复重建[28-29]。

5 展 望

综上所述，众多研究结果表明整合素αvβ3在骨肉瘤中异常表达，通过TME内复杂的分子信号调节骨肉瘤相关细胞的运动、迁移、黏附和侵袭，从而影响骨肉瘤的发病和转移机制，因此可以推断整合素αvβ3可以作为肿瘤治疗的重要靶点。理论上以整合素αvβ3为靶点进行抗肿瘤治疗既可抑制血管生成，又可促进肿瘤细胞凋亡，但由于整合素αvβ3的机制错综复杂，目前只停留在体外实验研究上，未能通过临床试验证明其疗效。未来研究中整合素仍然是肿瘤治疗的有效靶点，但是需要新的临床前模型和针对骨肉瘤微环境的转化研究，为开发研制治疗骨肉瘤的新药提供理论依据。