胸腺上皮细胞发育分化的信号通路研究进展①

陈昌蓉 宋银宏（三峡大学医学院病原与免疫学系，感染与炎症损伤研究所，宜昌443002）

胸腺属于上皮-间质组织，分为皮质和髓质区，内含基质细胞和胸腺细胞［1］。胸腺微环境为T淋巴细胞增殖、分化和选择性发育提供了场所。胸腺上皮细胞（thymus epithelial cells，TECs）是胸腺微环境最主要成分。根据表型和定位，TECs可分为皮质胸腺上皮细胞（cortical thymic epithelial cells，cTECs）和髓质胸腺上皮细胞（medullary thymic epithelial cells，mTECs）［2］。随着年龄增长，胸腺在青春期以后会出现退化，而TECs数量减少、功能紊乱是胸腺退化的重要因素之一，可导致胸腺细胞发育、增殖缺陷以及外周T细胞功能障碍［3］。T细胞衰老使老年人更容易受到感染和癌症的影响，若能重建T细胞，将防止或逆转与老化相关的T细胞衰竭［4］。T细胞发育过程中与TECs相互作用，并涉及许多信号通路［5］。在细胞水平上可以将与TECs发育相关的信号通路分为细胞内信号分子核因子-κB（nuclear fac⁃tor kappa B，NF-κB）及其信号通路、细胞外信号分子骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，Bmp）、Wnt蛋白、音猬因子（sonic hedgehog，Shh）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGF）等及其相应通路、其他类信号通路如视黄酸（retinoic ac⁃id，RA）、缺刻分子（notch）及相应通路。研究TECs发育分化过程中涉及的重要信号通路将有助于更加全面理解胸腺微环境，为对抗胸腺退化和提高机体免疫力提供研究基础。

1 调控TECs发育分化的细胞内信号通路

1.1 转录因子 转录因子是高度保守的能识别DNA序列进而调控基因表达的蛋白质［6］。在胚胎发育第11～12天，源自骨髓的淋巴样祖细胞定植到胸腺组织，随后进行TECs的发育及分化［7］。第三咽囊TECs发育早期受到1组转录因子的调节，其中主要包含同源盒基因3（homeotic genes 3，Hoxa3）、配对盒基因1/9（paired box genes 1/9，Pax1/9）、眼缺失基因（eyes absent gene，Eya1）、Six1/4（six gene 1/4）和T-盒转录调控因子1（T-box transcription factor，Tbx1）［8-10］。在胚胎或出生后个体的胸腺中，叉头框转录因子（forkhead box）家族成员中的Foxn1在TECs发育阶段中最为重要［11］。各种信号转导途径调控Foxn1的表达及TECs的增殖、发育及分化。

1.2 NF-κB NF-κB家族包括NF-κB1（p105）、NFκB2（p100）、网状内皮增生病毒致癌基因同源物A（reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，Re⁃lA）、RelB和c-Rel，这些转录因子形成同源和异源NF-κB/Rel二聚体，参与炎症、应激反应、淋巴器官发育等不同的生物学过程［12］。当细胞处于静息状态时，κB抑制性蛋白（inhibitor of kappa-B，IκB）与NFκB/Rel二聚体结合组成异源多聚体，以无活性形式存在于细胞质中。在经典NF-κB信号通路中，多种刺激物可以激活IκB激酶（inhibitor of kappa B kinas⁃es，IKKs），使IκB磷酸化，并通过泛素-蛋白酶体途径降解，引起NF-κB1/RelA和NF-κB1/c-Rel异源二聚体的核易位以启动靶基因表达。而肿瘤坏死因子受体超家族（tumor necrosis factor receptor，TNFR）和经典NF-κB信号通路能共同激活非经典NF-κB通路。TNFR家族成员包括淋巴毒素β受体（lymphotoxinβ receptor，LTβR）、CD40和核因子κB受体活化子（re⁃ceptor activator of nuclear factor-κB，RANK）。当这些受体分子接受相应信号分子时，可以将信号转给接头蛋白TNF受体相关因子（TNF receptor associated factor，TRAF），TRAF随后激活NF-κB诱导激酶（nu⁃clear factor kappa Binducing kinase，NIK），活化后的NIK可以激活IKKα二聚体［13］。IKKα二聚体将NFκB2（p100）的羧基端残基磷酸化后导致NF-κB2（p100）泛素化，进而通过蛋白酶体加工成NF-κB2/p52并转运入胞核，启动细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、原癌基因（c-myc）等目的基因表达。

mTECs发育依赖于经典NF-κB途径，RelA、c-Rel激活后能直接调控RelB的表达，并最终调控mTECs分化；若TECs中的RelB完全失活，则导致机体的自身免疫疾病［9］。在胚胎发育过程中，mTECs祖细胞接受LTβR信号传导，激活非经典NF-κB途径 后RANK表 达 上 调［11，14］。RANK与 其 配 体（RANK ligand，RANKL）结合后，能刺激TECs增殖［15］。RIEMANN等人［16］揭示了经典和非经典NFκB通路之间建立mTECs自身免疫耐受的串扰机制，主要是通过诱导RelB的表达，共同作用并调控TECs的发育成熟，确保诱导T细胞的自身耐受。

1.3 组蛋白去乙酰化酶3 组蛋白去乙酰化酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）属于Ⅰ类组蛋白去乙酰化酶，具有调控染色质重塑和基因表达的作用［17］。mTECs分化需要HDAC3的参与。GOLD⁃FARB等人［18］通过RNA测序发现，TECs及各个亚群都高表达HDAC3，当条件性敲除TECs中的HDAC3后，mTECs几乎完全消失。根据qPCR结果，依赖于HDAC3特异转录因子包括Pou2f3（pou class 2 ho⁃meobox 3）、神经母细胞特异性转移因子（achaetescute complex homologue 1，AscL1）、FEZ家族锌指蛋白2（FEZ family zinc finger 2，Fezf2）、Ehf（extended hartree-fock）和SpiB。此研究证实了HDAC3是调控TECs分化的强有力的转录因子。

1.4 转录激活子3 新生鼠的胸腺髓质区形成胰岛样结构，随着时间增长，在出生几周后融合成1个连续的结构。除上述NF-κB信号参与mTECs发育以外，SATOH等［19］使用条件基因敲除鼠模型去除TECs中的信号转导和转录激活子3（signal transduc⁃er and activator of transcription 3，Stat3），证实Stat3介导的信号决定了髓质的结构从而决定了出生后髓质区的大小。

由以上可知，经典以及非经典NF-κB信号均能调控mTECs的发育。除了NF-κB信号以外，还有HDAC3和Stat3信号也能调控mTECs的发育。HDAC3是独立于NF-κB信号来参与mTECs的整个发育过程，此外Stat3信号是新生鼠mTECs发育所必需的。

2 调控TECs发育分化的细胞外信号分子及其通路

2.1 Bmp信号 Bmp是转化生长因子-β（transform⁃ing growth factor-β，TGF-β）超家族成员，在多种器官的形成和维持中发挥重要作用。Bmp信号通路主要由配体家族、受体以及下游信号分子Smads蛋白组成［20］。Bmp信号是由2个Ⅰ型Bmp受体和2个Ⅱ型Bmp受体组成的多聚体复合物传递，其中Ⅰ型和Ⅱ型Bmp受体是具有胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构域的单次跨膜蛋白。配体家族按照发现的时间顺序分为Bmp、生长分化因子（growth differentiation factor，GDF）、TGF、激活素（Activins）、Nodal和抗缪勒氏管激素（anti-mullerian hormone，AMH），这些分子总称为TGF-β超家族［21］。Smads是强有力的调控因子，其本身转录能力较弱，但却能通过染色质重塑和组织特异性机制转导信号。配体结合受体后，Ⅱ型Bmp受体磷酸化Ⅰ型受体，激活后的Ⅰ型受体招募并磷酸化受体调控Smads蛋白（receptor-regulat⁃ed smads，R-Smads）、Smad2和Smad3，进 而通过Smad蛋白将细胞表面的信号转运至细胞核，从而调控如Foxn1等靶基因表达［20］。

Bmp信号在TECs发育最早阶段起重要作用［22］。体外分析Bmp4对胎儿胸腺器官培养物（fetal thymic organ culture，FTOC）中胸腺细胞发育的影响，结果表明Bmp可阻滞胸腺细胞早期发育［23］。SWANN等人［24］使用Foxn1：Noggin转基因小鼠模型，通过去除间质区的Bmp信号后导致Foxn1在咽上皮细胞中的表达缺失，从而减少了胸腺中的功能性TECs的数量。该实验说明了胸腺生成早期阶段的复杂性，并表明了Bmp信号与Foxn1协同作用决定了有功能活性的TECs数量。尽管了解到在胸腺发育过程中，Bmp4下游关键靶基因是Foxn1，但对于如何启动Foxn1以及后续的TECs发育过程还尚无报道。

由以上研究可知，Bmp信号通路不仅在胸腺细胞发育早期阶段起作用，并且在TECs发育最早阶段也同样发挥重要作用。Bmp信号通路通过Foxn1靶基因调控TECs发育，但对于信号通路上下游具体的分子机制仍有待深入研究。

2.2 Wnt信号 Wnt蛋白是一类分泌型的糖蛋白，在胸腺内由TECs分泌，Wnt信号在动物胚胎的器官发育、组织再生和其他生理过程中发挥重要作用［25］。Wnt信号通路主要成员有分泌蛋白Wnt家族、跨膜受体Frizzled家族、糖原合酶激酶3β（glyco⁃gen synthase kinase，GSK3β）、轴蛋白（Axin）、结肠腺瘤性息肉蛋白（adenomaous polyposis coli，APC）、β-连环蛋白（β-Catenin）、以及T细胞因子（T-cell fac⁃tor，TCF）［26］。研究最多的是经典Wnt信号通路，β-Catenin是此信号通路的关键蛋白。在没有Wnt信号时，位于胞质中的β-Catenin被Axin-APC-GSK3β形成的巨大蛋白复合体捕获并被降解。当Wnt与受体Frizzled和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6结合后，引起一系列下游级联反应，β-Catenin从Axin-APC-GSK3β降解复合物中释放并积累于细胞质中，然后进入细胞核与TCF结合，从而激活下游Foxn1、c-myc、Cycin D1等靶基因的转录［27］。

与Bmp信号不同，Wnt信号主要促进了TECs后期阶段的发育［22］。HEINONEN等人［26］使用常规和突变小鼠模型，研究了Wnt4信号如何通过依赖于TECs机制调控胸腺的稳态，结果发现，Wnt4通过促进TECs及胸腺祖细胞的增殖来调控胸腺细胞的组成。LIANG、OSADA等［28-29］也报道，条件性基因敲除TECs中的β-Catenin或者过表达Wnt抑制剂都会导致胸腺萎缩。

由以上研究可知，Wnt信号通路在TECs发育过程中发挥重要作用。如果阻断该信号通路中关键的靶基因，那么胸腺的发育将受损。

2.3 Shh信号 哺乳动物刺猬因子（hedgehog，Hh）家族成员包括Shh、印度刺猬因子（indian hedgehog，Ihh）和沙漠刺猬因子（desert hedgehog，Dhh），它们共享同1个信号通路，广泛参与胚胎发育分化多个过程［30］。Shh信号主要由分泌型Shh配体、补缀同源物1（patched homolog，Ptch1）、平滑同源物（smoothened homolog，Smo）及下游的转录因子神经胶质瘤关联癌基因同源物（glioma associated oncogene homolog，Gli）组成［31］。当Hh蛋白与其细胞表面受体Ptch1结合后，即可解除正常情况下Ptch1对Smo的抑制，随后，Smo进入细胞，信号通路的末端是Gli1、Gli2和Gli3转录因子，进而发挥转录调控作用。Hh信号通路激活时，Gli2和Gli3能激活靶基因转录，当Hh信号通路失活时，Gli2和Gli3则阻止靶基因转录。

Shh信号在胸腺中表达后能调节T细胞的发育，但对TECs的发育分化作用不明确。SALDNA等人［31］用Gli-绿色荧光蛋白转基因报告小鼠模型，探讨了胎儿和成年期胸腺中的Shh信号通路对TECs发育分化的影响。结果表明，Hh信号通路在胎儿和成年胸腺的TEC中均有表达并且转录活跃；如果胎儿胸腺的TECs缺失Shh信号，则TECs数量减少、mTECs相对于cTECs数量也明显减少，并且cTECs和mTECs中的主要组织相容性复合物（major histo⁃compatibility complex，MHC）的表达均增加；Shh-/-、ShhcoKO以及Gli3-/-小鼠突变体条件性敲除成年小鼠TECs中的Shh也会引起TEC分化发生改变以及T细胞发育的变化，导致TECs数量、表达自身免疫调节因子的mTECs的比例减少［31］。

由以上研究可知，Shh信号通路在TECs内转导活跃、调控TECs尤其是mTECs的分化过程，以及调节cTECs和mTECs表面的MHCⅡ的表达。如果TECs缺失Shh，那么将引起TECs分化改变，进而使胸腺发育不良。

2.4 FGF信号 FGF在哺乳动物中包括22种多肽，能调节多种细胞迁移、增殖、分化、代谢以及神经发育过程。根据系统进化分析结果，FGF家族在小鼠和人类中存在7个亚家族，分别为FGF1、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF11、FGF19亚家族［32］。除了FGF11亚类是作用于细胞内以外，FGF能结合并激活4种跨膜酪氨酸激酶受体（FGFR1～FGFR4），引起细胞内信号传导级联反应，而上皮细胞中主要表达FGFIIIb［33］。一旦FGF高亲和力结合受体后，可激活不同信号通路，其中最为重要的信号通路为Ras-ERK 1/2信号通路［34］。此外，FGF可与其他信号分子相互作用，特别是Wnt信号，可共同参与组织再生过程。Shh和BMP同样能和FGF相互作用控制肢体再生的过程［34］。

TECs发育分化后需要扩增细胞数量，这有利于形成完整的胸腺微环境。FGF又称为角质细胞形成因 子（keratinocyte growth factor，KGF）。FGF7、FGF10由胸腺成纤维细胞分泌，它们的共同受体为FGFR2IIIb，其可促进TECs扩增而不是分化过程。ERICKSON等［35］发现在重组激活基因（recombina⁃tion activating gene，RAG）敲除的小鼠中体内注射重组KGF可以扩大发育不良的髓质小室，因此KGF和FGFR2IIIb信号传导可以影响TECs发育和功能。另外，所有上述的BMP、Wnt、Hh和FGF细胞外信号还能在体外促进胚胎干细胞来源的内胚层向表达Foxn1的TECs祖细胞方向分化［36-37］。

由上述可知，FGF主要是能使发育分化后的TECs数量扩增，从而有利于形成稳定的胸腺微环境。但是目前对于FGF信号通路的分子机制还有待于进一步的研究。

3 其他信号通路

除了上述细胞外分子和细胞内分子及相关信号以外，非上皮组织中的其他外部信号也参与调控胚胎时期或出生后TECs发育过程。RA是调控TECs功能和胸腺生成的重要调节因子，去除TECs中RA信号后，cTEC和CD80loMHCⅡlomTECs中与上皮细胞增殖、发育与分化相关的基因表现出亚群特异性的改变；而且cTEC有明显的增殖，这些改变导致胸腺细胞减少，幼年和成年小鼠的CD4、CD8单阳性细胞数量减少［38］。同样，Notch信号对于各种上皮细胞类型的分化至关重要，TECs表达各种Notch受体及下游的发状分裂相关增强子（hairy/en⁃hancer-of-split related with YRPW motif 1，Hey1）和Hey2靶基因，这表明激活了未成熟TECs中的Notch信号，抑制TECs分化，当依赖于Foxn1过度激活Notch1后会严重损害TECs发育，并使胸腺发育异常和萎缩［18，39］。研究表明通过Foxn1.Cre介导经典Notch信号通路激活Rbpj（recombining binding pro⁃tein suppressor of hairless）的缺失发现TECs数量变化不明显，表明TECs发育后期不需要Notch信号的参与［5］。与Wnt、BMP、Shh信号不同的是，Notch信号是通过细胞与细胞间通讯发生的［40］。

由上可知，TECs发育分化需要细胞内、细胞外以及其他类信号分子的参与，它们相互协调并调控TECs发育和分化，最终促进胸腺和T细胞的发育。

4 结语

TECs在胸腺微环境中扮演重要角色，cTECs能提供抗原对胸腺细胞进行阳性选择获得MHC限制性识别能力，并且mTECs表达自身抗原对胸腺细胞进一步进行阴性选择，使其获得中枢免疫耐受。与年龄相关的胸腺退化主要是由TECs缺陷引起的。因此，TECs可作为细胞治疗的潜在有效靶点，纠正免疫紊乱及治疗自身免疫性疾病，促进TECs增殖，也是恢复衰老个体的胸腺微环境、促进胸腺T细胞再生的最主要的驱动因素。尽管TECs对T细胞发育不可忽视，但是TECs及亚群的发育分化的信号通路及串扰机制还有待更深入研究。TECs发育分化的研究，也必将对临床中胸腺再生及自身免疫病提供更多有效的治疗策略。