毒品成瘾的免疫疗法研究进展

陈 琳，茹 琴，周 梅，吴钰祥

江汉大学 1体育学院 2医学院武汉生物医学研究院，武汉 430056

毒品成瘾一直是重大的世界性医疗和社会问题。《2018年世界毒品报告》指出，全球吸食毒品人数已达2.75亿，约占全球15至64岁人口的5.6%。《2018年中国毒品形势报告》指出，中国现有在册吸毒人数已超过240.4万名。中国几乎90%以上的戒毒人员在脱毒后会复吸，德国、美国等发达国家复吸率在80%～90%。目前普遍认为，毒品成瘾是一种慢性复发性脑病，以强迫性的觅药行为、持续性渴求和极高的复发率为特征[1]。可卡因、尼古丁、甲基苯丙胺和海洛因等毒品相对分子质量小，易穿过血脑屏障，导致神经系统整体水平的结构及功能可塑性改变[2]。

目前用于治疗成瘾的药物通常是激动剂或拮抗剂，但是准确预测潜在激动剂/拮抗剂的药物作用及靶点存在困难，并存在诸多不良反应。大约50年前，研究者开始探索利用个体自身的免疫机制来减轻毒品破坏作用的可能性[3- 4]，即免疫药物疗法，包括疫苗、抗体和代谢酶等在内，核心特征是毒品小分子免疫原复合物诱导机体产生免疫应答，主动或被动产生的抗体与血清中毒品小分子结合，形成的毒品-抗体复合物难以穿过血脑屏障，从而降低游离毒品浓度并阻止其在大脑的分布，最终影响毒品成瘾相关奖赏效应[5- 6]。各国学者围绕化学、免疫学和酶学进行了细胞、分子、基因等多层次研究，已经取得突破性进展。本文总结了近50年来可卡因、尼古丁、甲基苯丙胺和海洛因等精神活性物质的免疫疗法研究进展，以期对防治毒品成瘾药物的未来研发提供一些思路与帮助。

可卡因免疫疗法

可卡因是一种强效的精神刺激物质，滥用会造成急性中毒并对中枢神经系统有高度毒性，形成强烈的精神依赖[7]，然而迄今为止还没有药物被批准用于治疗可卡因成瘾。一些5-羟色胺和多巴胺能激动剂/拮抗剂已被尝试应用，普通抗抑郁药物也显示出一些益处，但效果都十分有限且有不良反应[8]。

自20世纪90年代中期以来，研究者积极寻求可卡因免疫药物治疗方法。1992年，Bagasra等[9]首次报道通过化学途径来制造可卡因疫苗，运用乳化可卡因，以血蓝蛋白为载体合成半抗原，辅以完全弗氏佐剂，动物实验显示有50%的免疫接种大鼠对可卡因导致的中枢神经系统影响表现出完全的抗药性，且保护程度与抗可卡因抗体的量密切相关。1995年，Carrera等[10]研制出第1种公认可靠的抗可卡因疫苗，以苯甲酰爱冈宁(可卡因甲酯的水解物)为原料，以血蓝蛋白为载体，用标准方法合成了以六碳连接体半抗原，后期Sakurai等[11]还合成了1种用两个酰胺基取代了六碳连接体两个酯基的半抗原，效价更稳定、更有效。接种了可卡因疫苗的老鼠被注射可卡因时，自发活动减少，精神运动效应被抑制，同时大脑中的可卡因含量降低[12]。1996年，Fox等[13]研发了由琥珀酰诺可卡因与牛血清白蛋白结合而成的疫苗，并证明注射可卡因后，接种疫苗的小鼠大脑中可卡因显著减少。此后不久，Ettinger等[14]通过光激活法制备了1种疫苗，将连接载体蛋白的连接剂插入可卡因的碳-碳键中，动物实验证实在接种此疫苗的大鼠体内形成了抗可卡因抗体。2000年，Schabacker等[15]报道了一种单克隆抗可卡因抗体疫苗，其结构模仿可卡因，可向免疫系统呈递可卡因分子的内部特征构象，接种此疫苗的小鼠血清中抗可卡因抗体水平与接种一般可卡因疫苗的小鼠相似，注射可卡因后，大脑中可卡因水平下降。目前常用的可卡因疫苗是由琥珀酰诺可卡因与霍乱毒素B结合而成，能有效诱导大鼠产生足以对抗可卡因自身给药行为的抗体水平[16]。该疫苗应用于恒河猴，发现血液中的抗体水平与抑制对食物奖励的反应有关，且没有不良反应[17]。2005年，Hrafnkelsdottir等[18]使用甘油佐剂，通过鼻内途径和皮下途径为小鼠接种琥珀酰诺可卡因血蓝蛋白疫苗，结果显示，与对照组相比，所有接受免疫的可卡因组在大脑中的可卡因含量都较低，表明黏膜抗体也可能在隔离可卡因方面发挥重要作用。

为了提高疫苗免疫原性，人们研制出一种全合成自调节疫苗，是将脂多糖的组分附着在具有目的半抗原和T细胞肽表位的短肽上，利用这种脂多糖-短肽复合结构将抗原和共刺激信号分子结构传递到免疫微环境中，有效提高了免疫应答效价[19- 20]。在20世纪90年代还研制出催化抗体，其沿着可卡因水解途径发挥作用[21]。半抗原是模拟引发水解反应的中间体，免疫应答产生的抗体将作为水解酶，催化可卡因的水解[22]，相对较少的催化抗体可以破坏更多的可卡因分子[23]。目前已研制出这种半抗原，能稳定地与血蓝蛋白结合，将此疫苗接种小鼠，可有效产生单克隆催化抗体[24]。随后，一种快速代谢可卡因的双突变可卡因酯酶催化抗体也被研发并正在进行 Ⅰ 期和 Ⅱ 期临床试验，初步显示出强效的可卡因清除效应[25]。更有研究者设想将这种酶催化抗体与疫苗产生的抗可卡因抗体一起使用，产生协同作用，进一步减少可卡因进入大脑的可能性[26]。

迄今已有5种可卡因疫苗完成或正在进行人体Ⅰ期和Ⅱ期临床试验，包括Xenova制药公司的TA-CD、康奈尔大学威廉医学院的Cocaine hapten-dAd5、Teva制药公司的TV- 1380和Indivior制药公司的RBP- 8000等。2002年，Kosten等[27]报道了琥珀酰诺可卡因与霍乱毒素B结合疫苗的首次临床试验，证明该疫苗耐受性良好，抗可卡因抗体在3个月时达到高峰，1年后下降到基线水平，抗体水平与疫苗剂量有关。2005年，Martell等[28]比较了两种不同剂量疫苗的效果，结果显示接受更高剂量疫苗的受试者血清中抗体水平更高，可卡因阳性尿液更少，服用可卡因后的欣快感也更低。2009年进行的一项115名受试者的试验同样发现，高抗体组比低抗体组或安慰剂组有更多的无可卡因尿液样本[29]。2010年的人体试验发现，抗体水平较高的受试者吸食可卡因的主观感受变差，尽管25%～30%受试者产生的抗体水平依然相对较低[30]。

尼古丁免疫疗法

诸多严重疾病与长期吸烟有关，烟瘾历来是最难戒除的成瘾之一，尼古丁是引起吸烟成瘾的主要因素[31]。尼古丁替代剂、一般抗抑郁药或尼古丁受体部分激动剂，对阻止尼古丁的正性强化作用有一定疗效，但是最近这类药物被怀疑会加剧抑郁情绪和自杀行为，而免疫药物疗法由于较少引起不良反应而逐渐兴起。

尼古丁-蛋白偶联物的合成早在40多年前就有报道，然而，研究目的是建立检测各种介质中尼古丁的方法。可卡因疫苗的研发成功极大激发了人们继续开发尼古丁疫苗的兴趣。迄今报道的所有临床试验中，尼古丁疫苗都是由尼古丁与载体蛋白连接或结合，再与明矾佐剂混合而成的结合疫苗[32]。相关研究发现，尼古丁半抗原具有5个可能的连接位点；各种类型的免疫原性载体工具也已经被应用，包括从传统的血蓝蛋白、重组霍乱毒素B蛋白亚基[33]、假单胞菌外逸蛋白A[34]、不需要佐剂的19残基构象偏向肽[35]到由Qb噬菌体形成的病毒样颗粒[36]等。所有经过动物接种测试的疫苗都产生了抗尼古丁的特异性抗体，尽管滴度高低不等，这些特异性尼古丁抗体可以有效减少进入大脑的游离尼古丁量，且减轻尼古丁诱导的自发活动增强[34，37]。特异性抗体还被证明可以在怀孕期间将胎儿大脑对该药物的接触减少40%至60%[38- 39]。目前有9种尼古丁疫苗进入了人体Ⅰ期和Ⅱ期临床试验阶段，例如Nabi制药公司的NicVAX[40]、Cytos制药公司的NicQb[36]和Xenova制药公司的TA-NIC等。这些疫苗的Ⅰ期临床试验结果都认为受试疫苗安全且耐受性良好，只有轻微的局部和全身反应。然而，对NicVAX和NicQb的大规模Ⅱ期临床试验结果显示，迄今为止取得的疗效有限。NicVAX试验包括201名受试者，经过12个月的治疗后，总成功率为11%。NicQb的试验包括159名受试者，总成功率为29.5%。在这两项研究中，高滴度应答者均获得了更好的效果，进一步强调保护作用与抗体的数量直接相关[36，41]。

早期研究报道了提高尼古丁疫苗免疫效价的方法。一项是使用双价疫苗，该疫苗具有两个不同连接物附着位点，因此呈现单独结合和联合结合两种方式，对血清抗体浓度的影响在双价疫苗组中被证明是相加的，显示的抗体反应比单独的两种疫苗都增强[42]。另外，Meijler等[43]率先使用限制性抗原技术应用于尼古丁疫苗的半抗原制备，结果发现可以改善受体与疫苗的结合效果，应用于啮齿类动物免疫后，其效价提高8～10倍，结合亲和力比未受限制的同类抗原提高了2～3倍。另一项研究验证了用主动免疫和被动免疫相结合比单独治疗产生更高的血清总抗体水平、更大的尼古丁药代动力学变化和更大的运动敏化衰减[44]。最新研究表明，通过进一步优化结合疫苗的组分，包括半抗原[45]、连接剂[46]、载体蛋白[47]等和改进佐剂[48]，使用纳米颗粒支架[49]或脂质体微囊[50- 51]包装疫苗，将疫苗与其他类型的戒断药物结合[52]，含有尼古丁特异性抗体表达基因的病毒载体基因转移治疗[53]等，将大幅度提高尼古丁疫苗效价。

甲基苯丙胺免疫疗法

甲基苯丙胺是高度成瘾的新型合成毒品，反复使用会导致强烈的依赖和渴求，复吸率也极高，目前还没有理想的药物用于治疗甲基苯丙胺成瘾和复吸[54]。免疫疗法针对尼古丁和可卡因都显示出了希望，但甲基苯丙胺疫苗用于治疗甲基苯丙胺滥用仍处于研发的初级阶段[55]。

由于甲基苯丙胺的分子体积小且化学表位有限，诱导出高浓度的、高亲和力的甲基苯丙胺特异性抗体面临诸多困难。目前已有数个研究团队报道了一系列甲基苯丙胺半抗原的制备。2001年，Byrnes-Blake等[56]首次报道了主动免疫治疗甲基苯丙胺滥用的实验，他们运用甲基苯丙胺类似物与血蓝蛋白耦合形成的半抗原给大鼠免疫接种，历经53 d的3次接种后，大鼠体内产生了显著的抗甲基苯丙胺抗体效价，该作用被证明是持续稳定的。2009年，Duryee等[57]将甲基苯丙胺半抗原以共价形式连接到肽结构上，这一肽结构包含了具有构象偏倚、反应选择性等特性的分子佐剂YSFKPMPLaR，用该疫苗免疫的大鼠产生了有效的抗甲基苯丙胺血清抗体，可以改变大鼠甲基苯丙胺静脉自我给药行为。随后有研究报道，运用巯基甲基苯丙胺半抗原(S)-氮-(2-(巯基)- 6-(3-(2-(甲胺基)丙基)苯氧基)己酰胺与马来酰亚胺活化蛋白偶联制备甲基苯丙胺疫苗，质谱分析显示疫苗中两种不同的载体蛋白上都有高而可控的表位密度[58]。使用此方法原理，利用巯基甲基苯丙胺半抗原与血蓝蛋白共价结合产生甲基苯丙胺疫苗，进行免疫接种可以阻止大鼠甲基苯丙胺引起的摄食行为反应障碍[59]。此外，使用甲基苯丙胺6号表位-血蓝蛋白结合疫苗进行免疫接种可以产生惊人的高抗体浓度，阻止甲基苯丙胺诱导的大鼠自发活动和体温调节紊乱[60- 61]，而另一种琥珀酰甲基苯丙胺-血蓝蛋白结合疫苗可以产生有效的抗甲基苯丙胺血清抗体，进而改变甲基苯丙胺诱导的小鼠自发活动[62]。

尽管甲基苯丙胺疫苗的研发已经取得一些进展，但是主动免疫效价依然较低，而甲基苯丙胺吸食过量带来的心脑血管危害往往是快速而严重的，因此人们认为被动免疫可以部分克服这些限制，更能及时地发挥中和、隔离作用。在过去的15年里，甲基苯丙胺被动免疫研究得以发展。研究发现，小鼠来源的高亲和力单克隆甲基苯丙胺抗体能显著降低大鼠甲基苯丙胺自身给药行为[63]，甲基苯丙胺抗体还可以防止高剂量甲基苯丙胺引起的血压、心率升高和运动激活[64- 65]。2014年首次在健康志愿者体内进行嵌合抗甲基苯丙胺单克隆抗体的人体研究，检测了一种抗甲基苯丙胺单克隆嵌合抗体ch-mAb7F9在健康志愿者中的安全性和药代动力学[66]。然而，由于相对较高的生产成本和非肠外给药方式的限制，将单克隆药物转化为实际的人类药物治疗受到了阻碍[67]。有研究尝试运用基因技术，将一种携带单克隆抗体基因片段的病毒载体注入动物或人体，以便体内生产人源化单克隆片段，可以延长免疫应答效应保留时间[68]。新近已有报道将含有甲基苯丙胺抗体基因片段的重组腺相关病毒表达在小鼠体内，可减轻甲基苯丙胺诱导的小鼠高自发活动[69]。本研究团队也基于卵黄抗体生成原理，尝试利用甲基苯丙胺疫苗对禽类进行连续多点皮内免疫，从蛋黄中分离、提纯、精制富含特异性抗甲基苯丙胺卵黄抗体[70]，用于治疗甲基苯丙胺急性过量中毒和成瘾。卵黄抗体优势在于产量大，符合动物福利，生产成本低；与人类交叉反应少；可以嵌入人源化片段修饰。

海洛因/吗啡免疫疗法

海洛因是一种半合成阿片类药物，其天然母体是吗啡。海洛因可以轻易地穿过血脑屏障，同时快速脱乙酰生成6-乙酰吗啡，然后生成吗啡[71]。持续的阿片类药物滥用可导致药物耐受及强迫性觅药行为等神经、精神障碍[72]。目前阿片类药物使用障碍的治疗方案包括使用美沙酮或丁丙诺啡作为阿片受体激动剂的药物替代治疗[73]；阿片类药物拮抗剂纳洛酮和纳曲酮治疗阿片类药过量的治疗方案[74]等。这些方法被证明是有效的，但也存在缺点，包括住院康复费用高、不良反应多和治疗后复发率高等[75- 76]。

吗啡疫苗首次应用于20世纪70年代早期，当时在1只恒河猴身上测试了一种含有吗啡样半抗原的结合疫苗[4]，但由于不久后出现了治疗阿片类药物成瘾的药物疗法(当时看来更有希望的美沙酮)，这项工作没有进一步开展[77]。20世纪90年代中期毒品疫苗研究重新兴起，重点是可卡因和尼古丁，然而因半抗原设计不合理、佐剂选择困难、缺乏严格的临床前期研究等[78- 79]，阻碍了吗啡疫苗领域的进展。

继1984年首次采用海洛因脱甲基方法制备海洛因半抗原之后，2011年研究人员制备出第1代海洛因硫醇半抗原及海洛因羧酸半抗原，再分别通过巯基马来酰亚胺偶联和酰胺偶联，将巯基半抗原或羧酸半抗原偶联到载体蛋白表面的赖氨酸，并发现羧酸半抗原的效价较高[80]。此外，研究者比较了3种最常用的载体蛋白血蓝蛋白、白喉类毒素和破伤风类毒素之间的免疫原性差异，发现破伤风类毒素能产生最大的抗半抗原效价，在对抗海洛因诱导的小鼠镇痛方面表现最好，且与羧酸半抗原的偶联效果最佳。研究还发现，除了明矾之外，Toll样受体- 9的激动剂胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸的量与疫苗的疗效与免疫结合力呈正相关，该佐剂可以通过增加疫苗剂量来达到更高的疗效。最终，通过对20多种半抗原、载体蛋白以及佐剂配方的优化，确定了1种由海洛因羧酸半抗原和破伤风类毒素以及胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸和明矾构成的新一代海洛因疫苗，使用该疫苗免疫的小鼠对致死剂量的海洛因具有显著的抵抗作用[81]。另外，该疫苗在大范围海洛因剂量的基础临床前小鼠模型和非人灵长类动物模型中都是有效的，用此疫苗免疫小鼠可产生海洛因免疫拮抗作用，使海洛因效力降低15倍。此外，疫苗的效果是持久的，可持续8个多月。疫苗对恒河猴也是有效的，在每个受试猴体内产生了显著且持续的抗体效价。在接种疫苗的猴子身上，经过6个多月的一系列海洛因注射后，接种疫苗产生的隔离抗体在计划控制反应行为试验中导致海洛因效力显著降低了4倍多。这些临床前研究结果为进一步评估海洛因疫苗的临床应用潜力提供了实验基础[82]。未来还需更深入的非人灵长类动物实验及临床试验进一步验证该疫苗效价和防治阿片类成瘾的确切作用。

问题与展望

疫苗接种效力是有限的，取决于所引起的免疫反应的大小、亲和力和特异性，目前面临的主要挑战是如何改进疫苗配方的内在免疫原性。未来的成瘾免疫治疗研发中，深入了解特定的B、T淋巴细胞群参与免疫应答的细胞和分子机制，将为开发更有效的防治毒品成瘾疫苗提供帮助。在临床试验中，基于B、T细胞的血液生物标志物预测疫苗疗效，可能有助于精准确定受益于疫苗接种的患者群。开发新的半抗原合成策略，使用免疫原性更强、特性更好的载体、更好的佐剂或颗粒支架以及尖端生物材料，将有利于生产更有效的防治毒品成瘾生物免疫制剂。被动免疫和主动免疫的协同应用将提供更大的治疗前景，但是这种方法成本较高，还需进一步探索更加经济有效的抗体，比如基于卵黄抗体生成原理的抗体及其进一步精制，未来也许是一个突破点。除此之外，其他生物制剂，如药物降解酶催化抗体也显示出良好的临床前和临床结果。在临床中，疫苗、抗药物单抗和酶以及药物还可以联合使用，以克服单独治疗方法的缺点，或对特定患者群体进行个体化治疗。