灵芝多糖抗肿瘤免疫调节机制的研究进展①

李亚晗 刘佳琳 王天添 刘玟妍 孙丽媛 李明成（北华大学医学技术学院，吉林 132013）

灵芝（G.lucidum）具有补益、益气、强心等神奇的药用功效，几千年来一直被用作促进身体健康、永葆青春活力、延年益寿的良药。现代医学研究表明灵芝具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗血糖、抗溃疡、抗癌和免疫刺激作用，尤其是它被认为是癌症的一种替代性辅助疗法［1‐2］。灵芝含有多种成分，例如糖蛋白、多糖、三萜、类萜、倍半萜、类固醇、生物碱、苯并吡喃衍生物和苯甲酸衍生物，它还包含一些矿物质，例如钾、钙、磷、镁、硒、铁和锌［3］。研究发现灵芝的抗癌特性主要归因于其多糖和三萜。灵芝多糖（ganoderma lucidum polysaccha-ride，GLP）由（1→3）、（1→6）‐α/β‐葡聚糖、糖蛋白和水溶性杂多糖组成。GLP通过多种机制，如抗增殖、促凋亡、抗转移、抗血管生成、抗炎、抗氧化和免疫调节作用，通过抑制肿瘤生长和转移，增强患者的免疫功能来执行抗癌作用［4］。

宿主免疫监视在识别和摧毁癌变的宿主细胞方面起着至关重要的作用，因此免疫治疗已成为癌症防治的主要策略之一［5］。越来越多的研究表明，GLP部分通过刺激免疫功能发挥抗癌作用。这主要归因于GLP可以激活T和B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞（dendritic cell，DC）和天然杀伤（natural killer cell，NK）细胞，它促进淋巴细胞的增殖，增强吞噬作用，增加细胞因子的产生，并增强NK细胞介导的细胞毒性作用。本文将重点讨论GLP的免疫调节抗癌作用及其潜在机制。

1 灵芝多糖对固有免疫系统的调节作用

1.1 GLP对巨噬细胞的影响巨噬细胞是免疫系统的“吞噬者”，吞噬并消化凋亡细胞和病原体（称为吞噬作用），并产生免疫效应分子［5］。GLP的体内治疗会激活肉瘤S180小鼠骨髓源性巨噬细胞，从而产生免疫调节物质，例如IL‐1β，TNF‐α和一氧化氮（NO）。GLP显著提高巨噬细胞吞噬功能，增强巨噬细胞介导的肿瘤细胞毒性。同样，GLP在体外激活巨噬细胞，并在培养基中增加各种细胞因子的水平，包括IL‐1β、肿瘤坏死因子（TNF）‐α、IFN‐γ和IL‐6［6］。GLP是小鼠腹腔巨噬细胞分泌MAPKs和Syk依赖性TNF‐α和IL‐6的诱导因子。Dectin‐1受GLP刺激，但类似Toll样受体4（TLR4）的信号传导并不参与GLP的生物学活性［7］。然而，TLR4的信号传导是否参与GLP的生物活性是有争议的，因为GLP被发现直接与TLR4、B细胞细胞膜Ig（membrane Ig，mIg）、7S核糖体蛋白和bZIP增强剂结合，并通过TLR4传递某些信号。除了GLP对上述细胞因子和趋化因子表达的影响外，GLP还诱导炎症细胞因子IL‐1的表达，这在一定程度上与其抗癌活性有关。GLP可上调人巨噬细胞和小鼠巨噬细胞IL‐1的分泌，上调IL‐1前体pro‐IL‐1和IL‐1转化酶的表达［8］。这归因于蛋白酪氨酸激酶/蛋白激酶C/MEK1/细胞外信号调节激酶（ERK）和蛋白酪氨酸激酶/Rac1/p21激活激酶/p38途径的激活［9］。

1.2 GLP对NK细胞的影响与细胞毒性T细胞不同，NK细胞在没有抗体和主要组织相容性复合物的情况下可以识别应激细胞，从而加快免疫反应，因此NK细胞对先天免疫至关重要［10］。结果表明，GLP可使人脐血单个核细胞中CD14+CD26+单核/巨噬细胞、CD83+CD1a+DCs和CD16+CD56+NK细胞的数量分别增加2.9、2.3和1.5倍。此外，GLP能将NK细胞介导的细胞毒性提高31.7%。口服灵芝提取物可增加1型T辅助细胞和巨噬细胞分泌细胞因子（IL‐6和IFN‐γ）的水平，并增强BALB/c小鼠的NK细胞活性和吞噬作用［11］。GLP部分与TLR‐4受体结合，激活ERK、c‐Jun N末端激酶（JNK）和p38 MAPK。GLP可刺激小鼠脾细胞IL‐1、IL‐6、IL‐12、IFN‐γ、TNF‐α、粒细胞‐巨噬细胞集落刺激因子（GM‐CSF）、粒细胞集落刺激因子（GCSF）和巨噬细胞集落刺激因子（M‐CSF）的表达［12］。GLP可增加小鼠脾脏DCs、CD4、CD8、调节性T、B和NK细胞的数量。低剂量GLP减轻了环磷酰胺引起的小鼠体重、NK活性、IFN‐γ产生和细胞毒性T淋巴细胞活性的降低，并抑制由于环磷酰胺给药引起的IL‐4水平的异常升高或降低［13］。慢性给药2.5 mg/kg GLP可加速骨髓细胞、红细胞、白细胞、脾脏NK细胞和NK细胞的恢复，增强T细胞和B细胞的增殖反应。增强巨噬细胞的吞噬和细胞毒性，并无明显副作用［14］。因此，低剂量GLP治疗可以加速免疫抑制小鼠从白细胞减少、骨髓抑制和免疫抑制中恢复，这对癌症化疗是有益的。

1.3 GLP对DC细胞的影响DC细胞是重要的专业抗原呈递细胞，对于启动辅助T细胞和细胞毒性T淋巴细胞的初次免疫反应是必需的［15］。GLP具有刺激正常人单核细胞衍生DC细胞和白血病单核细胞衍生DC细胞成熟的能力。GLP增加CD80、CD86、CD83、CD40、CD54和人类白细胞抗原DR（HLA‐DR）的细胞表面表达［16］。它还增强了IL‐12p70、IL‐12p40和IL‐10的产生。GLP诱导的人单核细胞源性DCs的活化和成熟是通过活化B细胞的核因子kappa轻链增强子（NF‐κB）和p38丝裂原活化 蛋 白 激 酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）途径介导的［17］。GLP（0.8、3.2或12.8 mg/ml）可增加培养的骨髓来源树突状细胞表面CD11c和I‐A/I‐E分子的共表达，提高DCs中细胞因子IL‐12p40的mRNA表达，增加培养上清液中IL‐12p40蛋白的产生。GLP还增强了成熟DC细胞诱导的混合淋巴细胞培养物中淋巴细胞的增殖。用GLP（100µg/ml）处理白血病单核细胞系THP‐1和U937可显著增加HLA‐DR、CD40、CD80和CD86的表达［18］。GLP通过促进细胞黏附、超氧化物产生、细胞周期阻滞和CD11b、CD14、CD68、MMP‐9、髓过氧化物酶等分化标志物的表达，诱导THP‐1白血病细胞向巨噬细胞样细胞分化。此外，GLP诱导的caspases和p53激活也有助于这种分化［19］。

2 灵芝多糖对T/B细胞的调节作用

2.1 GLP对T淋巴细胞的影响大量研究表明GLP是T淋巴细胞的活化剂。GAO等［20］研究表明，GLP能够显著增加小鼠细胞毒性T淋巴细胞对靶细胞的杀伤力以及NK细胞的活性。用GLP治疗可显著促进伴刀豆球蛋白A（concanavalinA，ConA）诱导的小鼠淋巴细胞增殖和IL‐2的产生［21］。GLP还能促进脾细胞增殖以及细胞因子如IL‐1α、IL‐1β、IFN‐γ、TNF‐α和TNF‐β的产生。有研究表明GLP还可以通过诱导DNA聚合酶α的表达，促进混合淋巴细胞培养中小鼠脾细胞的DNA合成。GLP可增加T淋巴细胞中IFN‐γ的表达以及小鼠脾细胞中IL‐1、IL‐2和IFN‐γ的表达。GLP增加静息T细胞中三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和二酰甘油（diacylglycer-ol，DAG）的生成，尽管它不影响ConA激活T细胞中IP3和DAG的生成，这表明IP3/Ca2+和DAG/蛋白激酶C（protein kinase，PKC）途径可能参与GLP对T细胞的免疫调节作用。进一步的研究表明，GLP可以激活鼠T细胞中的PKC和蛋白激酶A（protein ki-nase A，PKA）［22］。

B16F10黑色素瘤细胞可在细胞培养基中分泌大量IL‐10、转化生长因子β1（transforming growth factor，TGF‐β1）和血管内皮生长因子（vascular endo-thelial growth factor，VEGF）。研究表明，B16F10细胞培养上清液能抑制植物血凝素（phytohemaggluti-nin，PHA）刺激穿孔素和颗粒酶B的产生，抑制淋巴细胞的增殖。有趣的是，添加GLP可以完全或部分拮抗B16F10细胞培养上清对淋巴细胞的抑制作用［23］。GLP还能防止B16F10细胞减少淋巴细胞中CD71和Fas配体（FasL）的表达。此外，肺癌患者的血浆可抑制PHA激活的淋巴细胞的增殖，CD69表达以及穿孔素和颗粒酶B的产生，而这些成分也可以通过GLP治疗完全或部分逆转。用GLP处理B16F10黑色素瘤细胞和淋巴细胞的共培养物可增加培养基中CD69（T细胞活化和增殖的共同刺激分子）、FasL和IFN‐γ的产生［24］。

2.2 GLP对B淋巴细胞的影响B淋巴细胞在体液免疫中起重要作用，与T细胞或NK细胞不同，B细胞在其细胞膜上表达B细胞受体，使B细胞结合特定抗原并产生针对该抗原的抗体，此外，B细胞也呈 递 抗 原 并 分 泌 细 胞 因 子［25］。GLP激 活mIg和TLR4，后者发送信号激活B细胞，并通过核糖体蛋白s7和转录辅激活剂（胞内蛋白）启动巨噬细胞激活过程［26］。GLP可以通过增加B细胞的增殖和分化来激活B细胞。据报道GLP不仅使B细胞的百分比增加了2.5～4倍，而且还增加了B细胞的大小。同样，在体内用GLP治疗还可以激活脾脏和骨髓来源的肉瘤S180小鼠的B淋巴细胞，并诱导B细胞增殖和在小鼠中产生大量免疫球蛋白。从机制上讲，GLP可通过直接刺激B细胞中PKCα和PKCγ的表达来诱导B细胞表面CD71和CD25的表达，并增加B细胞免疫球蛋白的分泌［27］。

3 灵芝多糖对细胞因子的影响

3.1 增加抗肿瘤的细胞因子GLP在荷瘤小鼠体内治疗可提高小鼠血清中12种细胞因子和趋化因子的水平，包括KC（CXCL1）、MCP‐1（CCL2）、IL‐6、MIP‐1β（CCL3）、IL‐1β、IL‐12p40、IL‐12p70、RANTES（CCL5）、IL‐1α、TNF‐α、IL‐10和IL‐13［28］。GLP能增强晚期癌症患者的免疫反应。在一项非随机开放临床试验中，74例晚期结直肠癌患者以5.4 g/d的剂量服用GLP，持续12周。结果发现，GLP能提高CD3、CD4、CD8和CD56淋巴细胞计数，也能提高PHA的有丝分裂反应性、血浆IL‐2、IL‐6、IFN‐γ浓度以及NK活性，但降低血浆IL‐1和TNF‐α浓度。在另一项临床试验中，34例晚期癌症患者3次/d服用1 800µg的ganopoli（GLP提取物），为期12周。这导致血浆中IL‐2、IL‐6和IFN‐γ的平均浓度升高，IL‐1和TNF‐α的水平降低。在CD4∶CD8 T细胞比率不变的情况下，CD56+细胞的平均绝对数也增加，CD3+、CD4+或CD8+的数量与基础水平相比仅略有增加。此外，与基线相比，治疗导致平均NK活性显著增加［29］。

3.2 抗炎作用一些炎症介质，如TNF‐α、IL‐6、TGF‐β和IL‐10，已经被证明参与了癌症的发生和发展。GLP具有剂量依赖性的抗炎作用。服用GLP（100 mg/kg）可导致58%的炎症抑制，如卡拉胶诱导（急性）和福尔马林诱导（慢性）炎症试验所评估的［30］。GLP在体内外对O2‐，SO，HO˙，H2O2和2，2‐二苯基‐1‐吡啶酰肼（DPPH）具有较强的清除活性。研究表明，5 mg/ml的GLP提取物能在2 min内显著降低DPPH自由基，15 min内完全清除DPPH自由基。GLP提取物通过Nrf2介导的信号通路在体外诱导结直肠癌组织中超氧化物歧化酶（superoxide dis-mutase，SOD）、过氧化氢酶、Ⅱ期脱毒酶、醌氧化还原酶1（NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQO1）和谷 胱 甘 肽S‐转 移 酶P1（glutathione S‐transferase，P1GSTP1）［31］。GLP还能增强SOD和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，并以剂量依赖的方式降低暴露于γ射线照射的小鼠或宫颈癌大鼠体内的丙二醛水平。

4 小结与展望

临床前和临床研究表明，GLP不仅具有抗肿瘤细胞增殖、促凋亡和抗迁移作用，而且具有抗血管生成和免疫调节作用。因此，联合应用GLP有利于肿瘤患者接受常规化疗和/或放疗，有助于提高患者的免疫功能，减轻常规治疗的毒副作用。然而，仍然需要更多的研究来进一步阐明免疫调节作用的机制以及GLP的直接抗癌作用，特别是为不同的病人群体设计更为合理的临床试验也是必要的。