膝骨关节炎病证结合动物模型的研究进展

杨 威郭斯印易志勇黄旭东韩清民∗张荣华

(1.广州中医药大学第三临床医学院,广州 510405; 2.广州中医药大学第三附属医院,广州 510405;3.暨南大学,广州 510632)

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种快速增长的致残性疾病,估计全球已有2.5 亿人受累,使医疗负担持续剧增,最常累及膝关节(knee osteoarthritis,KOA),其高发病率与老龄化、肥胖和关节慢性损伤相互作用有关,KOA 是一种全关节慢性炎性进展性疾病,涉及到关节软骨、关节下骨、韧带、关节囊、半月板、滑膜和周围肌肉功能与结构的改变[1-3],按病因分为原发性(primary knee osteoarthritis, PKOA)和继发性[4],继发性KOA 包括创伤后(post-traumatic knee osteoarthritis, PTKOA)、废用性和继发于其他系统性疾病的KOA,由于具体病机不明,尚无有效的干预手段[3]。而动物实验是人们深入认识KOA发病机制和探索有效治疗手段的重要途径[5-6]。

KOA 属中医学“骨痹”范畴,中医认为其病因病机为“本痿标痹、本虚标实”。肝肾亏虚,筋骨失养为本痿;邪气痹阻,经络不畅为标痹[7]。大致可分为气滞血瘀证、寒湿痹阻证和肝肾亏虚证,据此遣方用药以减轻KOA 患者疼痛、改善关节功能和调节整体生理功能进而提高生活质量,为进一步探究其内在机理,将动物作为人类受难的替代者,分别模拟血瘀、寒湿和肾虚证型KOA 患者,结合国内外相关文献及笔者KOA 动物造模经验,可将其分为现代医学病理学造模和中医证型造模两大类,以最常用的家兔和大鼠[8]为例,分析常用造模方式的内在机制及优缺点以供参考。

1 KOA 的现代医学病理学造模

经典的现代医学病理学造模分为自发造模和人工诱发,后者分为侵入性和非侵入性造模,侵入性包括关节腔注射、关节内外手术,非侵入性包括关节制动和机械创伤[9-10],而目前复制KOA 动物模型最常用的造模方法为关节内手术、石膏绷带制动和关节腔药物注射法。评价KOA 模型最经典的指标是关节软骨损伤的Mankin 评分[11]和改良Mankin评分[12],后者已逐渐取代前者,而国际骨关节炎研究组织(OARSI)推荐的滑膜组织半定量评分有助于KOA 早期评价[13]。

1.1 关节内手术

关节内手术是不同程度破坏或切除前后交叉韧带、内外侧副韧带或半月板等稳定关节的软组织,使关节不同程度地失稳,改变其生物力学,增加关节表面摩擦,进而促使关节软骨退变诱发KOA。此法模型成功率高,可重复性好,造模时间短,病程可控,但具体操作要求较高,需要严格无菌,术者要掌握膝部解剖并具备一定的外科操作技能,以尽可能减少手术创伤出血。

1.1.1 传统Hulth 法及Hulth 改良法

改良的Hulth 法即切断内侧副韧带及前交叉韧带、内侧半月板切除,而Hulth 法还需切除后交叉韧带[9]。王婧等[14]在大鼠KOA 三种造模方式的比较中发现Hulth 模型组6 周即可造模成功:膝关节软骨组织大体观可见软骨变薄或部分缺损、表面充血、有小裂缝,伴有骨赘形成;光镜下可见软骨表层较大缺损,软骨细胞层分离,且细胞肥大呈空泡状,潮线消失,软骨下骨小梁断裂,Mankin 评分高,相当于KOA 中晚期。Hulth 法建模太快,不利于观察不同时期KOA 滑膜、软骨及软骨下骨的病理表现;而改良的Hulth 法操作简单,创伤小,可动态观察KOA周围组织的病理表现,采用改良Mankin 评分判定分期。张冲等[15]采用改良Hulth+强迫兔奔跑法(约200 m/d),发现2 周软骨改变,6 周进入平台期,10周可见晚期OA 表现,13 周建立典型KOA 模型。

1.1.2 前交叉韧带切断术(ACLT)、半月板部分或全部切除术

ACLT(anterior cruciate liagament transection)模型是最早为大众熟知的模型,也是KOA 研究中最常用到手术模型。钱洁等[16]认为ACLT 建模时间较长,术后6、8 周分别为KOA 的早期和中期:关节大体可见软骨面失去光泽,滑膜肿胀;镜下观显示软骨形态紊乱,甲苯染色变浅,软骨细胞变性坏死增多,Mankin 评分较高,更适合用作发病机制、药物治疗方面的研究。谭启钊等[17]对比三种OA 模型,术后8 周发现其膝关节软骨和软骨下骨都发生明显病理改变且各有差异,其中ACLT 组大鼠软骨破坏较重,软骨下骨没有显著改变。在体实验,半月板切除引起内外侧关节面受力不均而导致KOA 样改变,类似于人类膝内外翻导致的内外侧KOA[18],部分切除的机理与全切类似。陈康等[19]认为切断兔的内外侧半月板和前交叉韧带是制作KOA 模型较为理想的方法,造模2、6、10 周后,从实验动物活动表现和大体标本观察,兔右膝关节均呈典型不同时期KOA 特征。本法创伤相对较小,成功率高,容易控制实验方向,但对术者要求更高,稳定性较差,成模时间较长。

1.2 石膏绷带制动

原理是增加或减少作用关节面的应力诱导产生关节软骨退行性改变。动物实验一般以膝关节为观察对象,按照作用关节是否为观察对象可分为固定观察关节法和固定非观察关节法,按照制动机制不同可分为过屈位和过伸位制动,笔者以为前者主要是限制关节伸直造成关节软骨萎缩性变化,后者主要是限制活动,周围组织对关节面产生过度压力进而导致KOA,过屈位操作简单,成功率高,而过伸位制动与临床上KOA 发病机制类似,近年来应用更为广泛[20]。

无论是否固定在过伸、屈位或中间位,也无论是否对膝关节施加外力,固定一定时间后的膝关节软骨都会出现类似临床的退变。以新西兰大白兔左后肢为观察对象,田育魁等[21]或王丽娟等[22]人分别采用高分子绷带于过屈或过伸位固定,8 或6周后成功建立KOA 模型。亦可用此法观察过度负重的右膝与空白组关节软骨的病理变化,但目前尚未见报道。

1.3 关节腔药物注射法

关节腔药物注射法是将诱导炎症的复合物或生物制剂直接注射到关节腔,多用于研究药物抑制炎症或减轻疼痛的疗效。最常用的化学诱导剂有木瓜蛋白酶和碘乙酸(sodium monoiodoacetate, MIA),其次是尿激酶和胶原酶等。木瓜蛋白酶分解软骨基质中具有抗压作用的糖蛋白,促进关节软骨降解,诱发KOA。王平乐等[23]将1.6%的木瓜蛋白酶注射到兔的膝关节腔内,每只0.5 mL,每3 天一次,共两次,2周后取材发现注射的膝关节软骨退变。而目前更为常用的是MIA 注射,它能抑制三羧酸循环中的三磷酸甘油醛脱氢酶导致关节软骨降解,王宝娟等[24]发现7.5 mg/kg 的MIA 为建立家兔KOA 模型最小有效剂量,且成活率高。最近,刘军等[25]分别在第1、7 天将10 ng/mL 的TNF-α 注射到大鼠关节腔,4 周后成功构建KOA 模型。此法操作简便、创伤小且成模时间短,但是药物剂量因动物或部位而异,首次注药后关节肿胀严重阻碍后期注药,往往需要使用其他化学催化剂[10],反复注射易出现硬结、溃烂,所形成的模型与人类KOA 有所差异。

现代医学病理学造模方法繁多,且不断创新,无法一一列举,每一种具体造模方式都有其独特的优缺点,需要根据其特有的致病机制、病理变化特点及自身需求选择合适的方法模拟所需KOA 模型。

2 KOA 的中医证型造模

古今医家对KOA 病因病机的认识可大致概括为正虚、邪实和虚实夹杂三大证。为模拟临床KOA证型,目前中医证型造模也以肾阳虚、血瘀和寒湿证为主,与前文论及的KOA 现代医学病理学造模相结合形成病证结合的复合模型。目前中医证型的评价是以《医学实验动物学》中临床表现与证型的对应为主。

2.1 肾阳虚证KOA 模型

肾阳虚证KOA 模型是肾阳虚证+KOA 病证结合的模型,肾阳虚证模型是研究最早的中医证候动物模型[26],按机理大致可分为现代医学病理学造模和中医病因学造模,且以前者多见。根据《辨证论治实验方法学》对肾阳虚证候评分,结合中医基础理论进行证候评价[27],典型表现为精神萎靡、发抖畏寒喜暖、卷缩弓背、大便稀溏和抓取无抵抗等。

2.1.1 现代医学病理学造模

中医肾包含现代医学的性腺功能,性激素水平下降可反映肾气的衰退,并且下丘脑-垂体-靶腺轴的功能紊乱是肾虚证的主要病理基础[28]。研究表明cAMP、cGMP 及其比值可反映肾虚证[16],肾阳虚时,cAMP 降低,cGMP 升高,cAMP/cGMP 降低,反之为肾阴虚。肾阳虚证的现代医学病理学造模可分为肾上腺皮质、甲状腺、性腺功能抑制模型等。最早和最为常用的是糖皮质激素法,且最为国内外所认可的方式是将氢化可的松注射液以10 mg/(kg·d)的剂量注射到成年大鼠腹腔持续15 d 便可成模[29]。其次最为常用的是去势法,切除动物双侧睾丸或卵巢,可成功模拟肾阳虚证,但也有研究认为此法不仅创伤大且性腺轴的反馈途径中断,去势后的动物不能较好地模拟临床肾阳虚患者表现[26]。由于激素造模严重影响骨骼肌力量和骨的代谢,进而影响KOA 模型,病证结合模型中多采用去势法。陈颖颖等[30]通过多种不同造模方法比对发现去除双侧睾丸联合Hulth 法[9]更适合建立雄性SD 大鼠KOA 肾阳虚证模型;根据Hartley 豚鼠关节软骨快速衰老的特性,笔者前期单纯采用去除双侧卵巢法成功建立豚鼠绝经后PKOA肾阳虚证模型,操作虽然简单,但耗时太长,并且去势后骨小梁明显缺失,骨质疏松特别严重[12]。最近,陈颖颖等[31]对雄性SD 大鼠采用Hulth 造模法+不同浓度腺嘌呤灌胃成功构建肾阳虚型KOA 模型,并发现100 mg/kg 是最佳浓度。

2.1.2 中医病因学造模

肾藏精,主骨生髓,主持人体发育和生殖,肾虚多由先天禀赋不足或后天失养,房劳内伤,久病耗气,年老或受惊所致。肾阳虚证中医病因学造模可分为:房劳模型、老年大鼠肾阳虚模型和“恐伤肾”模型等[32],房劳模型主要是针对单个雄鼠和多个动情期雌鼠同笼,诱导雄鼠房事不节;老年大鼠肾阳虚模型是根据老年大鼠自然衰老所致肾阳虚衰;“恐伤肾”模型主要是利用猫吓鼠,使动物精神-神经内分泌-效应器之间相互关系发生紊乱影响代谢功能,出现肾阳虚证。然笔者尚未发现运用中医病因学方法或复合KOA 病理学造模法建立肾阳虚型KOA 复合模型的文献报道。

目前,肾阳虚造模法种类繁多,病理造模方法远多于病因造模,而后者被越来越多的研究者青睐,但两者都存在明显不足,前者只能反映临床肾阳虚病理的单个方面,后者病因和病证之间不存在一一对应的关系,病证结合模型将是未来发展的方向[33]。

2.2 血瘀证KOA 模型

血瘀证的临床表现为舌质青紫、瘀斑等,动物实验的标准是舌质瘀紫,尾色瘀青,血流缓慢、血黏度增高等,常用的造模方法是肾上腺皮质激素注射法[34],具体是氢化可的松10 mg/(kg·d)肌肉注射,13 次用药后肾上腺素0.36 mg/kg 皮下注射一次。2013 年,刘振峰等[35]用此法+经典Hulth 造模法成功建立了动物体征和血液流变学均符合血瘀证的大鼠KOA 模型;尽管临床上血瘀证常见,且常以活血法治之,但此后未见单纯血瘀证KOA 动物模型报道,多是复合证 KOA 模型。刘爱峰等[10]及 Liu等[32]用关节内注射木瓜蛋白酶0.05 mL(1.6U)/关节剂量,并将雄性Wistar 大鼠膝关节在50℃环境下作用2 h,观察局部淤血肿胀、疼痛和活动受限程度及软骨病理变化,得到肾虚血瘀型KOA 模型,此法亦属病理学造模范畴,简便易行,周期短,可重复性高,且成功解决了传统木瓜蛋白酶因首次注射后关节肿胀而致后续注射受阻的难题。截止目前,笔者尚未发现血瘀证病因学造模及客观评价指标的文献报道。

2.3 寒湿证KOA 模型

《内经·痹论篇》曰:“风寒湿三气杂至,合而为痹也。”风寒湿邪是重要的病因。2016 年,李艳彦及其团队等[36]采用石膏伸直位固定法+冰水站立复制寒湿证KOA 模型,通过将大鼠放入(6±0.5)℃的水中6 h,而后予以双下肢石膏固定18 h,如此反复6周后行关节病理学检查低倍镜下可见软骨表面不平,滑膜层增多、增粗,较多血管翳形成,高倍镜下发现大量软骨细胞破坏,排列紊乱,较多炎性细胞及坏死组织分布。随后,赵乐等[37]对其改进,通过交替将大鼠双下肢伸直位石膏固定和自然站立于(6±2)℃冰水中各6 h,持续6 周,发现模型组大鼠关节软骨Ⅱ型胶原及TGF-β 表达明显下降,iNOS(一氧化氮合成酶)表达明显升高。2020 年,孙力威等[38]采用石膏固定+低温环境刺激(4℃气温箱8 h)+冰水站立成功建立雌性SD 大鼠肾阳虚寒湿证KOA 模型,用高剂量黄芪桂枝五物汤灌胃后肾阳虚表现消失,趾温也正常,关节软骨病理学表现及血清炎性指标明显好转,以此反证肾阳虚寒湿证KOA复合模型成功。此法为中医病因学造模,即采用致病因素干预,但其作用时间、评判标准或病理学造模未见报道。

3 总结与展望

据中医史料记载,与KOA 相似症状的病名有骨痹、痛痹、寒痹和鹤膝风等。KOA 中医病因病机是肾阳虚、寒湿和淤血,基本证型是肾阳虚、气滞血瘀证和寒湿阻滞证,分别对应肾阳虚、血瘀证和寒湿证KOA 动物模型。祖国医学从整体辨证论治的角度出发,治疗KOA 有独特的优势,而有关KOA 的中医证候动物模型研究及相关文献资料缺乏或零散,尤其缺少病因学模型研究,由于单一病证病因较多,且同一病因可诱发不同证型,加之临床上患者病证的复杂性、动态性及伴随疾病的相互影响,严重限制了中医药对KOA 的深入研究。普遍认为KOA 证型是多种病因相互作用的结果,进而出现多种证型兼夹或转变,因此实际造模时可以将多种基本模型按需求和内在规律组合建立符合中医临床的复合证候模型,但干预因素过多,实际操作困难,模型稳定性和可靠性不高,另外,动物的食水、垫料、光照及周围环境等饲养条件也极为重要。

KOA 病因病机不明,单纯用现代医学或祖国医学都不能有效地解除患者病痛,而两者结合疗效显著,为探究其内在机理,由此过渡到基础实验,将西方先进的KOA 造模理念结合中医证候模型建立病证结合动物模型[39]将是人们进一步认识KOA 病因病机以及药物防治的主流方向。当前KOA 病证结合模型主要以现代医学病理病因造模为主,缺乏体现中医证候的病因或诱因,在现代医学建模基础上施加中医病因可能有助于解决,另外科学地评价病证结合模型很难,为推动KOA 模型更好地服务于科研,武晏屹等[40]以KOA 中、西医最新临床诊疗规范为依据,创造性地提出了动物模型与中、西医的临床吻合度,也更有利于病证结合模型的发展;宋亚刚等[39]提出“证候”评价指标+“病”评价指标综合评估,具体需要与兽医合作采集动物的“四诊信息”,结合基因组学、代谢组学和蛋白组学等信息,宏观微观相结合共同评价,必要时运用经典方剂佐证,这将是病证结合模型的发展方向。