具有肾上腺发育毒性的外源化学物及其机制研究进展

夏 璇 ，陈雅文 ，汪 晖

（1.武汉大学基础医学院药理学系，湖北 武汉 430071；2.发育源性疾病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430071）

肾上腺作为下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamicpituitary-adrenal，HPA）轴的终末效应器官，负责机体多种甾体激素的合成，对维持妊娠、促进胎儿生长发育和出生后机体功能有重要意义［1］。在胎儿时期，肾上腺还存在细胞色素P450氧化酶3A（cyto⁃chrome P450 3A，CYP3A）亚族表达，提示其不仅是重要的内分泌器官，还承担着药物等化学物代谢的功能，是外源化学物作用的重要靶点［2］。发育毒性是指发育期（个体从受精卵形成直至出生后性成熟的各个阶段）暴露环境因素对子代造成的有害作用，是当今社会愈发关注的一个焦点。研究表明，妊娠期外源化学物暴露可导致子代肾上腺发育不良，表现为结构及功能方面的损害，还可引起发育编程改变及成年后多种慢性疾病易感［3-4］。然而，目前关于肾上腺发育毒性的研究甚少，其毒性发生机制缺乏系统地阐述。本文就具有肾上腺发育毒性的外源化学物及其发生机制研究进展进行综述，以期为肾上腺发育毒性早期评价系统的建立提供参考。

1 具有肾上腺发育毒性的外源化学物分类

目前关于肾上腺发育毒性的研究甚少，本文将已有文献报道的具有肾上腺发育毒性的外源化学物大致分为环境毒物类、药物类和食品类进行相关介绍。

1.1 环境毒物类

能引起肾上腺发育毒性的环境毒物包括内分泌干扰物和空气污染物等，其中内分泌干扰物占据重要地位。这类化合物既包括持久难降解的有机污染物（如双酚A、多氯联苯和有机氯农药等），又包括易分解的极性除草剂、杀虫剂、洗涤剂降解产物、动物或植物激素以及某些重金属等。这些物质因其与内源性激素相似的分子结构，易被细胞受体识别，从而干扰机体的内分泌功能。研究表明，肾上腺是内分泌干扰物的主要毒性靶器官之一。一项出生队列研究发现，妊娠期母体暴露于双酚A，可干扰子代肾上腺功能并存在性别差异，表现为女性基础皮质醇水平增加而男性下降［5］。动物实验证实，妊娠期暴露于多氯联苯和邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯等均会影响雄性大鼠肾上腺皮质酮的分泌水平［6］。尼古丁作为香烟中的主要成分，也可影响大鼠胎仔肾上腺结构及功能，导致肾上腺发育不良［7］。

1.2 药物类

孕期用药的安全性问题一直备受关注。多种临床药物具有肾上腺发育毒性，如美替拉酮、地塞米松、倍他米松、氟西汀、白藜芦醇和红霉素等［8-11］。临床研究显示，妊娠期使用糖皮质激素（glucocorti⁃coid，GC）类药物会影响胎儿肾上腺发育，如妊娠期应用倍他米松后，二维超声显示胎儿肾上腺体积显著减小［12］；产前应用地塞米松治疗时，不适当的疗程和剂量会引起胎儿宫内发育迟缓（intrauterine growth retardation，IUGR）和早产，同时子代表现出肾上腺功能低下［13］。在绵羊模型中，妊娠期暴露氟西汀后，其子代血浆皮质醇浓度异常［9］。此外，本课题组在大鼠模型上发现，妊娠期地塞米松暴露，雌、雄胎鼠血皮质酮水平显著降低，肾上腺甾体合成功能受到抑制，但出生后存在明显性别差异（待发表）。另外，在原代人胎儿肾上腺皮质细胞上，给予3-甲基胆蒽、苯巴比妥、地塞米松和白藜芦醇均可干扰细胞皮质醇、醛固酮和孕酮的合成［11-14］。以上结果表明，妊娠期用药所致的肾上腺发育毒性不可忽视。

1.3 食品类

妊娠期食用过量乙醇、茶、咖啡和低蛋白食物等也被证实会引起肾上腺发育毒性。国内外一系列研究证明，乙醇及其代谢产物乙醛均可对机体内分泌和代谢功能产生长期影响。本实验室发现，大鼠妊娠期乙醇和咖啡因暴露均可致IUGR胎鼠肾上腺形态发育异常，其类固醇生存因子1（steroido⁃genic factor-1，SF-1）及甾体合成酶系统表达降低，内生皮质酮生成减少；且这些IUGR子代正常饮食至成年后，其肾上腺SF-1及甾体合成酶系统表达仍以降低为主［15-16］。de Oliveira等［17］发现，妊娠期低蛋白饮食会增加成年雄性子代大鼠肾上腺重量及血清皮质酮水平。可见妊娠期不良饮食习惯对子代肾上腺发育具有深远影响，可延续至成年。

2 肾上腺发育毒性的作用机制

多种外源化学物妊娠期暴露可引起子代肾上腺发育毒性，其毒性效应的产生可通过不同机制干扰个体肾上腺的正常发育，包括外源化学物介导的表观遗传修饰异常、细胞自噬和（或）凋亡、内质网应激及代谢损伤等直接作用及糖皮质激素介导的间接效应。

2.1 表观遗传修饰异常

表观遗传修饰是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生可遗传性的改变。它是生命现象中普遍存在的一类基因调控方式，主要包括DNA甲基化、组蛋白共价修饰和非编码RNA等，通常协同调控基因表达，且易受到营养和外源化学物等多种环境因素的影响，在胚胎正常发育和疾病发生发展中扮演重要角色。

Bogdarina等［18］研究发现，妊娠期地塞米松暴露可直接作用于子代大鼠基因启动子反应元件，引起基因启动子区去甲基化，如子代肾上腺血管紧张素Ⅱ受体1b（angiotensinⅡreceptor type 1b，AT1b）启动子CpG残基甲基化减少，进而上调AT1b受体基因表达，同时伴随着雄性子代血压升高。本实验室近期在妊娠期地塞米松暴露所致大鼠IUGR模型上也发现，地塞米松可激活GC受体（GC receptor，GR）并招募组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDAC），降低类固醇生成急性调节蛋白（steroido⁃genesis acute regulatory protein，StAR）启动子区的组蛋白乙酰化水平，导致胎肾上腺甾体合成功能抑制并延续至出生后（待发表），甚至具有跨代遗传效应（待发表）。此外，在妊娠期尼古丁暴露所致大鼠IUGR模型中，观察到胎鼠肾上腺甾体合成功能受抑制，尼古丁处理胎肾上腺皮质细胞NCI-H295A，发现SF-1启动子区组蛋白H3K9和H3K14位点乙酰化水平显著降低，抑制SF-1表达，从而降低肾上腺细胞皮质醇合成水平［19］。在2种肾上腺细胞pHFAC和NCI-H295R上，尼古丁可诱导StAR启动子中Pax6结合序列nt-377位点的CpG甲基化以介导肾上腺发育毒性，且这些现象在细胞水平可持续5～10代［20］。另外，StAR启动子中阴阳1（Yin Yang1，YY1）介导的组蛋白去乙酰化修饰可能在尼古丁对肾上腺细胞StAR表达的抑制作用中也起重要作用［7］。除DNA甲基化和组蛋白共价修饰外，非编码RNA也可介导发育毒性的发生。微RNA Let-7家族可作为肾上腺皮质醇合成的分子开关，且已被证实与StAR mRNA之间存在功能性结合位点，并在翻译阶段调控其表达［21］，可能介导外源化学物所致子代肾上腺发育不良。综上，外源化学物可通过表观遗传修饰异常，引起子代肾上腺发育不良。

2.2 细胞自噬和内质网应激

细胞自噬既是一个生理过程，也是一个病理过程，主要包括自噬体发生、形成、运输与融合和溶酶体的裂解4个阶段。自噬与胎儿发育密切相关，同时还可参与妊娠期外源化学物暴露所致的子代脏器发育毒性的发生。目前，大部分的研究支持自噬是一种机体保护机制。本实验室研究发现，妊娠期乙醇暴露可诱导大鼠胎仔肾上腺甾体激素合成功能抑制，而自噬增强是妊娠期乙醇暴露所致子代肾上腺功能抑制的代偿保护作用［22］。在细胞水平，Jung等［23］用熊果酸处理肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC-12后发现明显细胞毒性，且细胞内泛素化的蛋白质P62积累、微管相关蛋白轻链3（microtubuleassociated protein light chain 3，LC3）-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加，表明熊果苷可诱导细胞自噬，进一步检测其下游信号通路相关基因表达，发现信号通路被抑制，说明熊果酸对PC-12细胞的毒性作用是通过损害自噬进程产生的。可见，细胞自噬功能受损与肾上腺发育毒性密切相关。

内质网是细胞内一种重要的单层膜性细胞器，主要作用是参与细胞内蛋白质的修饰、折叠和Ca2+的贮存及释放。多种生理、病理因素可诱导细胞发生内质网应激。当机体接触毒物时，诱发的内质网应激可导致细胞内未折叠或错误折叠的蛋白质蓄积，损伤细胞功能，破坏机体内质网稳态，从而导致暂时或持久性的病理反应。Bose等［24］发现，用不同浓度尼古丁处理绵羊肾上腺细胞会影响细胞StAR的蛋白质折叠和活性及胆固醇摄入，从而减少类固醇激素的产生，抑制肾上腺甾体合成功能。提示内质网应激可能参与肾上腺发育毒性的发生。

2.3 外源化学物的代谢活化

外源化学物进入机体后，经生物转化作用，大部分转变为无毒的、亲水性强的代谢物，被机体排出体外；而有些外源化学物本身无毒，进入机体后，经过机体的生物转化作用却生成了有毒的代谢物或中间体，而对机体造成损伤，称为代谢损伤。前期研究表明，人胎儿肾上腺皮质细胞中存在CYP1A，CYP2B/2C和CYP3A等代谢酶，在细胞水平给予3-甲基胆蒽、苯巴比妥或地塞米松后，发现可干扰原代人胎儿肾上腺皮质细胞中皮质醇、醛固酮和孕酮的合成，这可能通过外源化学物代谢相关的CYP450异构体激活起作用［14］。提示外源化学物的代谢活化是导致肾上腺发育毒性的重要机制之一。

2.4 糖皮质激素介导的间接效应

除外源化学物对肾上腺发育的直接损伤外，妊娠期外源化学物暴露所致的母体应激状态，可引起母体及胎儿体内GC水平改变。已知GC对胎儿生命发育过程具有持久性、决定性的影响。越来越多的研究发现，在出生前后GC水平还可影响子代肾上腺发育，甚至具有编程效应［16，25-26］。GC与GR结合后，调控基因表达的同时可招募转录因子以及相关表遗传酶共同调控基因转录表达［27］。本课题组研究发现，在妊娠期咖啡因暴露的大鼠IUGR模型上观察到子代存在母源性GC过暴露，可激活肾上腺GR，增强肾上腺DNA甲基转移酶（DNA methyl⁃transferases，Dnmt）1、Dnmt3a、HDAC1 和 HDAC2的表达，致使胎鼠肾上腺SF-1启动子总甲基化率升高及H3K9和H3K14乙酰化水平降低，从而抑制甾体激素合成酶的表达和肾上腺皮质酮的生成［16］。此外，胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）信号通路作为内分泌调节系统的核心，参与调节宫内时期各组织的发育、分化及代谢过程［28］。研究提示，IGF1信号通路也参与了肾上腺皮质细胞的增殖过程［29］。前期本实验室通过体内外实验证实，妊娠期咖啡因暴露下，大鼠胎仔血清高水平皮质酮（而非咖啡因）可增强胎仔肾上腺GC激活系统（11β-羟类固醇脱氢酶1/2比值、GR和CCAAT增强子结合蛋白表达），抑制肾上腺IGF1表达、肾上腺细胞增殖和甾体激素合成功能，由此导致胎仔肾上腺结构与功能发育迟缓［3，30］。以上结果提示，妊娠期接触外源化学物所致的高水平糖皮质激素可调控肾上腺发育，介导其发育毒性的发生。

3 肾上腺发育毒性的远期危害

肾上腺发育毒性的远期危害表现为成年子代肾上腺局部低基础活性、高应激敏感性变化及“GCIGF1轴”编程介导的肾上腺形态及功能代偿性增强，进一步导致子代成年后多种慢性疾病易感。

3.1 肾上腺发育编程及稳态改变

不良宫内环境会引起子代肾上腺发育毒性，进一步导致肾上腺发育编程改变。在妊娠晚期地塞米松暴露的猪模型研究中发现，血中促肾上腺皮质激素（adreno-corticotropic-hormone，ACTH）和皮质醇水平低于正常对照组，提示HPA轴功能抑制伴随肾上腺发育不良［37］。本室前期研究发现，大鼠妊娠期外源化学物（如咖啡因、尼古丁和乙醇）暴露所引起宫内母源性高GC可影响胎儿自身的甾体激素合成功能，导致出生后血ACTH和皮质酮在基础状态下降低，但给予慢性应激后血ACTH和皮质酮的变化率增加［38-40］。可见，宫内不良环境下子代肾上腺存在局部低基础活性和高应激敏感性变化，这种改变可加重外周脏器GC依赖性的糖脂代谢絮乱，影响机体正常运转。

宫内时期，IGF1是诱导干细胞富集和功能分化的重要因子，参与调控多种器官发育过程。本室研究发现，妊娠期咖啡因和乙醇暴露，子代大鼠出生前后血皮质酮水平与肾上腺IGF1信号通路呈现明显负相关［3，15］，即宫内时期血皮质酮水平升高时，IGF1信号通路表达抑制，同时甾体合成酶系统表达及内生皮质酮含量减少。出生后早期，在血皮质酮水平降低的同时，肾上腺GC活化系统抑制，但IGF1信号通路增强，同时甾体合成酶系统下游表达增加，致使内生皮质酮生成逐渐增强［15］。在给予高脂饮食或慢性应激后，肾上腺局部出现GC-IGF1轴依赖性的甾体合成功能改变［25］。以上提示，妊娠期外源化学物暴露所致的IUGR子代肾上腺局部存在“GC-IGF1轴编程”，可负反馈地调节出生前、后肾上腺的结构与功能发育，维持肾上腺发育稳态。

3.2 肾上腺发育编程改变对某些疾病易感性的影响

肾上腺作为胎源性疾病发生发展的核心脏器，其发育编程对于成年个体健康至关重要。妊娠期外源化学物暴露，一方面可直接损伤胎儿肾上腺等多种组织器官，另一方面这种外源因素所致的高GC暴露环境对子代肾上腺发育具有编程效应，可进一步增加子代成年后慢性疾病易感。HPA轴宫内神经内分泌代谢编程改变是IUGR子代慢性疾病易感的可能机制之一。妊娠期外源化学物暴露下子代大鼠肾上腺甾体合成功能低下从宫内延续至出生后甚至成年，而在高脂饮食或慢性应激下出现高应激敏感性变化［25］，同时，肝和胰腺等外周组织出现GC依赖性的糖脂代谢絮乱［41-42］；其次，各脏器的GC活化系统增强，抑制IGF1相关的脏器功能变化，可致宫内低IGF1而出生后高IGF1水平。这种“GC-IGF1轴编程”可促使胎儿“节俭表型”发生，以助胎儿度过危险期而求得生存，在出生后早期诱导脏器功能代偿性发育，表现出追赶性生长，如肝脂代谢功能和成骨细胞增殖功能等明显增强，由此增加IUGR子代全身性代谢紊乱及多脏器相关疾病如非酒精性脂肪肝、高胆固醇血症、糖尿病、骨关节炎和骨质疏松症等的易感性［39，43-46］。综上，子代肾上腺宫内发育不良与出生后的追赶性生长可进一步诱导和加剧各脏器局部功能发育与全身发育的不协调性，最终导致子代成年后慢性疾病易感。

4 结语

综上所述，肾上腺在机体发育中占据重要地位，而妊娠期环境毒物、药品、食品等暴露均可诱发子代肾上腺发育毒性，并可进一步导致其肾上腺发育编程改变及成年疾病易感，其发生机制主要与外源化学物介导的表观遗传异常修饰、细胞自噬和（或）凋亡及内质网应激和代谢损伤等直接作用及糖皮质激素介导的间接效应有关。然而，由于对分子机制的了解有限及研究技术的瓶颈，肾上腺发育毒性的表型存在明显性别差异和跨代遗传等现象未能很好地解释，有待深入研究。另外，建立肾上腺发育毒性早期评价系统，开展妊娠期有害因子评估，寻找早期干预靶点，也是未来的研究重点，有利于降低成年代谢性疾病易感的风险。