关节软骨修复和再生：从细胞到仿生支架药物递送研究进展

张兴宇 陈世益

1 复旦大学运动医学研究所（上海200040）

2 复旦大学附属华山医院运动医学科（上海200040）

关节软骨因其乏血管、乏细胞的特性而难以修复和再生[1]。在所有接受关节镜检查的病人中有软骨病变的占60%，其中67%是局灶性软骨缺损[2]，关节软骨损伤临床发病率较高。外伤、劳损、老龄化等均是软骨损伤的常见病因及风险因素[3，4]。软骨损伤可诱发关节疼痛、骨关节炎甚至功能障碍[5]。临床上针对软骨损伤的治疗包括保守治疗[6，7]及有创手术治疗[8，9]。但是，目前这些已经临床应用的治疗方法均有相应的局限性[10]。组织工程仿生支架技术的研究和发展为软骨难以修复和再生这一临床难题提供了一定的解决办法[11]。本文综述近些年来仿生支架及其递药方式的研究成果，有利于了解其对关节软骨损伤的治疗作用和未来向临床转化的潜力。

1 关节软骨损伤的临床治疗

软骨损伤的治疗可以分为两类，即以缓解临床症状为目的的保守治疗和以修复软骨损伤为目的的手术治疗。由于关节软骨无血运和神经营养，系统性给药促使软骨修复和再生的能力极其有限。即使关节腔内给药，也并无直接和充足的证据表明软骨可以得到修复，仅在一定程度上阻断炎症，缓解疼痛[12]。微骨折术、软骨移植术、自体软骨细胞植入术等手术方式有助于软骨修复，但是再生的软骨和天然软骨仍有差异，并有各自的局限性。单髁置换术和关节置换术则是软骨病变严重者最后的选择，大多数是老年病人，但因创伤较大而面临诸多限制。

1.1 非药物保守治疗

非药物治疗主要方式是通过宣教减轻体重、改变生活和运动方式、支具康复、物理治疗等。研究显示，在体质指数（body mass index，BMI）超过30 kg/m2人群中，减轻体重可以改善已经存在的关节疼痛、僵硬等临床症状[13，14]。但是，运动锻炼对已有关节软骨损伤者的软骨含量、厚度、基质成分、分子病理标志物并无明显的促进作用，现有研究证据不足以证实锻炼对软骨修复有积极作用[15，16]。然而，缺乏机械性力学刺激也会引起关节软骨软化、变薄[17，18]。因此，维持适当力量训练，防止软骨退变加重是必要的。对于单间室关节炎，支具治疗可以改善畸形的下肢力线，有一定的矫正作用[19]。物理治疗也是常用的保守疗法之一，但其总体疗效不确定[20]。不过，临床前研究强调了某些物理治疗可以通过调节软骨代谢过程，延缓早期软骨病变，如脉冲电磁治疗、脉冲超声治疗、冲击波治疗等[21，22]。

1.2 药物保守治疗

由于60 岁以上人口中有软骨损伤临床症状的病人占15%以上[10]，而且他们多数会有其他系统的合并症，故长期使用系统性药物往往弊大于利。关节腔内注射用药会减少系统性药物副作用，同时提高关节腔内有效药物浓度。非甾体抗炎药（nonsteroidal antiin⁃flammatory drugs，NSAIDs）、透明质酸（hyaluronic ac⁃id，HA）是较有代表性的药物。NSAIDs通过直接降低关节软骨内的环氧化酶-2 来减少炎性反应[23]，从而减轻关节僵硬、改善关节功能[24]。也有研究指出NSAID的临床有效性是由安慰剂效应导致的[25]，尚需要较高证据等级的临床研究来进一步明确其作用。关节腔内注射HA能够增强关节软骨的粘弹性，也可以促进软骨分泌内源性HA，从而改善滑膜组织状态、避免炎性反应加重[26]。值得注意的是，研究发现HA和NSAID联用对关节疼痛的缓解更加有效[27]。保守治疗的主要目的大多在于缓解关节疼痛症状和改善关节功能，从而延缓软骨病变的进展。

1.3 有创手术治疗

传统手术治疗方法有微骨折、自体及异体软骨移植、软骨细胞移植等。微骨折术基于软骨细胞来源于骨髓间充质干细胞这一理论，通过洞穿软骨下骨，暴露骨髓腔内干细胞，从而使后者分化出新的软骨，得以修复受损区域。这项手术可以促进关节功能快速恢复，但是存在修复组织以纤维软骨为主、修复质量良莠不一的缺陷，并且缺乏长期疗效的随访研究[28]。相比较于异体软骨移植，自体软骨不存在组织活力差、免疫排斥、疾病传播以及伦理等问题，但是会受到病变区域过大时供区组织不足的限制[29]。而软骨细胞移植是将自体关节非负重区软骨细胞扩增、植入关节损伤局部，旨在代替原有受损细胞功能[30]。目前，第三代软骨细胞移植技术已经发展到了生物可降解支架荷载细胞再生软骨[31]，可以产生类透明样或者透明样软骨。不过，软骨细胞移植常常需要两次手术，并且术后5年随访发现其功能恢复和微骨折术相近[32]。另外还有报道软骨细胞移植术后2年随访IKDC 评分低于软骨移植术[33]。因此，各种手术疗法仍有各自局限。

2 软骨修复和再生的临床前研究

组织工程仿生支架技术为软骨修复和再生提供了诸多可能[34，35]。组织工程三大要素包括种子细胞、仿生支架、细胞因子，其中，软骨组织工程的种子细胞多为干细胞[36，37]，但是干细胞治疗的安全有效性和分化可控性仍存在较大争议[38-41]。因此，无细胞仿生支架荷载药物是当前研究热点方向之一[42-44]，有些种类的软骨修复材料甚至已经进入了初期临床试验。

软骨仿生支架的制备和表征主要涉及三维结构特性、力学性能等研究内容。支架材料的孔径大小、孔隙率和连通性是药物、生长因子促进体内外细胞增殖、分化及发挥功能的基础，高孔隙率和高连通性有利于细胞表型的维持和细胞外基质蛋白的合成[45，46]，合适的溶胀率和渗透性也是软骨分化和基质合成的重要保障[47-49]。而力学性能评估主要集中在剪切力、拉伸力和压缩力的测试上，这三种属性高度依赖支架材料的选择、构建和细胞外基质合成的速度、密度[50-52]。在软骨临床前研究中，组织工程仿生支架来源于胶原、明胶、壳聚糖、透明质酸和丝素蛋白等，这些材料在体外实验和体内实验中均取得令人瞩目的进展。

2.1 不同材料的软骨仿生支架

2.1.1 胶原支架

胶原是软骨内细胞外基质的主要成分之一，胶原的存在有助于软骨细胞的黏附，并且刺激分泌新的胶原，故胶原为主要成分的仿生支架是较有前景的软骨组织工程材料。Muhonen 等在大动物模型中证实了胶原支架对软骨修复有积极作用，但是其优势并不明显[53]。在初期临床研究中，Schuttler等评估了使用胶原脱细胞支架修复软骨缺损的临床效果，发现术后随访5年的失败率达18%[54]。而Perdisa等报道了胶原和羟基磷灰石脱细胞复合支架修复软骨缺损具有良好临床评分的结果，但是该临床报道并未设立对照组，而且在47.8%的病例中发现了不正常的软骨下骨过度生长[55]。这可能会导致软骨局部力学不平衡，甚至使软骨进一步受损。

2.1.2 明胶支架

明胶是一种来源于胶原、通过水解反应得到的天然材料。与单纯胶原相比，因为不具有免疫原序列，所以很少引起免疫反应。Chen 等制备了一种高孔隙率、高连通性的多孔明胶支架，具有良好的抗压性能和细胞黏附性，有利于软骨细胞的三维培养和细胞外基质的分泌[56]。而Rajzer等用3D打印技术制备的明胶和聚乳酸多孔复合支架能够提供较强抗张性能，促进软骨细胞增殖，但具有一定的细胞毒性[57]。

2.1.3 壳聚糖支架

与天然软骨中糖胺聚糖的生物活性相近是壳聚糖的主要特点，并且壳聚糖对于生长因子的结合和荷载也具有天然优势，同时也具有较强的抗菌性能[58]。Shamekhi 等合成了无毒性、可降解且适于软骨细胞培养的壳聚糖水凝胶支架，并且交联后的三维支架抗压性能更强、对细胞活力的促进作用更为明显[59]。而壳聚糖支架和脱钙骨基质复合支架可进一步通过改变孔径大小从而改善软骨细胞在支架中的分布，体内实验也证实了相应软骨再生基因表达的上调[60]。

2.1.4 透明质酸支架

透明质酸在人体内分布广泛，在关节内主要用于降低摩擦力、改善关节活动能力。透明质酸支架因其无毒、可降解、生物相容性好等天然特性在临床前研究中应用较多。Lebourg 等报道了一种简易的脱细胞透明质酸和聚乙内酯复合支架，在配合微骨折术的同时能够促进软骨修复[61]。透明质酸三维多孔支架对人源骨关节炎软骨细胞的亲和性较高，并且可以维持这些受损细胞的表型和分化状态[62]。透明质酸支架在临床上已经有所应用。Gobbi 等在近年陆续报道了透明质酸支架联合活化骨髓提取物治疗关节软骨缺损，与微骨折术相比，中长期随访发现透明质酸支架植入术后具有更高的Tegner、IKDC和KOOS评分[63，64]。

2.1.5 丝素蛋白支架

作为一种新型天然高分子材料，丝素蛋白无毒、无污染、无刺激、可降解、相容性好以及机械性能优异。Ribeiro 等制备了一种高孔隙率、高连通性的丝素蛋白支架，其干相杨氏模量达到2.97 MPa，体外实验证实其可以诱导间充质干细胞分化，增加糖胺聚糖合成、软骨相关标记物，例如Ⅱ型胶原的生成[65]。而Zhou 等制备的丝素蛋白和硫酸软骨素复合支架相较于单纯丝素蛋白支架抗压性能更强，更能促进软骨基质表型，并且降低已损伤软骨内的炎性因子白介素IL-1β的水平[66]。

因此，仿生支架用于软骨的修复和再生具有美好前景，但同时仍有一定局限性。即使复合多种材料，有时也并不能完美解决软骨损伤的问题。故未来研究中进一步优化支架的制备工艺和流程，探索不同支架材料的选择和配比，或者引入不同种类的药物、生长因子及细胞因子可能会有助于突破软骨损伤修复、再生困难的瓶颈。

2.2 不同种类的支架递药策略

2.2.1 转化生长因子

荷载生长因子或者细胞因子的支架则提供了进一步加强软骨修复和再生的方法。Wang 等将转化生长因子TGF-β1 荷载到胶原支架上，可刺激软骨再生，促进新生软骨和临近软骨的整合[67]。将TGF-β1 结合至胶原膜上也可用于软骨修复，缓解早期病变导致的关节疼痛[44]。而明胶支架缓释TGF-β1 能够明显促进软骨糖胺聚糖的合成[68]。其他材料的支架例如壳聚糖支架荷载TGF-β1、TGF-β3 也具有促进软骨再生的作用[69]。丝素蛋白和脱细胞软骨基质相结合的支架，在荷载TGF-β3后有良好缓释效果，从而模拟体内软骨再生环境[70]。此外，荷载TGF-β1亲和肽的壳聚糖支架能够通过募集内源性TGF-β1 进一步参与软骨修复和再生[71]。

2.2.2 骨形成蛋白

荷载骨形成蛋白BMP-2、BMP-7和BMP-9等生物活性因子的仿生支架均具有修复软骨损伤的作用[69]。其中BMP-9 和胶原支架联用可以促进间充质干细胞的成软骨分化，进一步发挥软骨修复作用[72]。同时荷载BMP-2和TGF-β1两种生物活性因子能够促进糖胺聚糖合成和软骨下骨形成、促进骨软骨界面的整合，且控释效果可达数十天[73]。

2.2.3 胰岛素样生长因子

胰岛素样生长因子IGF-1主要作用有维持软骨内稳态、平衡基质内糖胺聚糖的合成和分解过程等。研究发现IGF-1 可以促进软骨分化、Ⅱ型胶原DNA 的转录，加快软骨细胞外基质分泌和沉积。同时，IGF-1能够抑制TNF-α和IL-1β介导的软骨降解过程，从而减缓成熟细胞外基质的降解[74]。

2.2.4 新型药物及生物活性因子

某些种类的生物活性因子能够招募间充质干细胞参与软骨修复和再生，例如荷载间充质干细胞亲和肽E7的丝素蛋白支架可以作为一种新型药物递送策略从而促进软骨修复[75]，相似的研究还有荷载能够招募间充质干细胞的基质衍生因子SDF-1α的丝素蛋白支架，从而诱导干细胞参与软骨分化和再生[76]。

因此，药物、生长因子及细胞因子的应用将成为未来软骨组织工程支架临床应用的研究方向之一，而亲和肽、基质衍生因子等基于内源性干细胞迁移的递药策略也可被视作一种干细胞治疗的替代思路。

3 总结

软骨损伤的治疗在临床上具有局限性，现有保守疗法和手术技术对软骨的修复和再生仍需持续改进，而软骨组织工程支架为这一问题提供了一定的解决方法。目前常用的支架材料包括胶原、明胶、壳聚糖、透明质酸和丝素蛋白等，这些材料的主要特点在于无毒性、可降解、生物相容性好，有利于体内应用。但是，单纯支架往往因力学性能不佳、在体内稳定性差等原因限制了进一步应用，导致复合支架应运而生。两到三种材料共同合成复合支架，起到互补作用。同时，荷载生长因子或者细胞因子，通过模拟关节软骨局部微环境为软骨再生提供有力条件，甚至可以招募到内源性细胞参与修复，免去外源性细胞植入的生物安全隐患。然而，各种组成、不同性能的支架层出不穷，但仍无产品可以在临床广泛应用。所以，未来软骨组织工程需关注制备简易、性能稳定、疗效确切的支架材料，尽早实现在临床上的转化。