沙眼衣原体III型分泌系统效应蛋白研究进展

张荣荣，高 哲，贾天军

沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis，Ct)是专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，可导致人类眼部和生殖道疾病，甚至引起失明或者不孕症[1]。所有的衣原体都具有独特的双相发育周期，即有感染性的原体(EB)和无感染性的始体(RB)。在接触宿主细胞后不久，EBs内化并限制在一个小液泡内，称为包涵体[2]。在包涵体中EBs分化为RBs，RBs经二分裂复制使包涵体不断扩大，随后RBs开始向EBs转化。为了建立适应Ct复制的细胞内生态位，Ct需依赖III型分泌系统(T3SS)及T3SS效应蛋白操纵宿主细胞。T3SS是一种由20～35 种蛋白质组成的蛋白质转运系统[3]。沙眼衣原体 T3SS横跨包涵体膜和宿主细胞内、外膜，直接将效应蛋白分泌到宿主细胞质。一旦进入宿主细胞质，T3SS效应蛋白可与宿主细胞发生联系，在Ct的入侵、存活和释放等方面发挥重要作用。随着研究技术不断发展，人们对T3SS功能的研究日渐深入，本文就目前沙眼衣原体T3SS效应蛋白功能的研究进展进行综述。

1 沙眼衣原体T3SS

沙眼衣原体T3SS是一种独立的多组分分泌系统，结构复杂，其基本组成部分包括：①细胞质辅助蛋白(AC)，由一系列伴侣蛋白和调节蛋白构成，在细胞质中发挥作用；②跨越Ct内膜、周质间隙和外膜的基础装置蛋白，在系统中高度保守，是分泌的核心部分；③针尖复合物蛋白(NC和TC)，它们连接Ct与宿主细胞膜的空隙；④真核细胞膜上形成孔的分泌性转运蛋白(Tr)，分泌底物通过这些孔进入宿主细胞浆[4-5]，因此T3SS被称为“分子注射器”。T3SS不但存在于Ct中，也存在于许多革兰氏阴性菌中，如耶尔森氏菌属(Yersiniaspp)、沙门氏菌属(Salmonella)、福氏志贺氏菌属(Shigellaflexneri)、衣原体属(chlamydia)等。但与这些蛋白分泌系统不同的是，沙眼衣原体T3SS效应基因既不位于毒力质粒上，也不排列形成致病岛(PAIs)，而是分散在染色体上，分布在4个群组中并排列形成多个操纵子[6]。在感染过程中，EB一旦接触宿主细胞，T3SS蛋白及其效应蛋白可被激活。效应蛋白是T3SS分泌的毒力蛋白，经T3SS直接被递送到宿主细胞，调节多种细胞功能从而使Ct受益。

2 沙眼衣原体T3SS效应蛋白及功能

沙眼衣原体T3SS表达多种效应蛋白，主要分为两个亚群：①转运并插入包涵体膜的效应蛋白，也称为包涵体膜蛋白(inclusion membrane proteins，Inc蛋白)；②在包涵体腔或宿主细胞内分泌的可溶性效应蛋白，即非Inc蛋白[7]。它们在Ct发育以及与宿主细胞的相互作用中均发挥重要作用，如IncA、IncE和Cpos可调节宿主细胞囊泡运输，IncD和IncV调节宿主细胞非囊泡运输，IPAM、InaC、Tarp、CT694和CT166均可调节宿主细胞骨架，其中Tarp、CT694和CT166还可促进Ct的侵袭。以下将详述沙眼衣原体 T3SS效应蛋白的功能。

2.1调节宿主细胞骨架和Ct侵袭 衣原体进入非吞噬上皮细胞伴随宿主细胞质膜的改变。目前已证明Inc蛋白IPAM和InaC参与微管、微丝的破坏和高尔基体的重定位，非Inc蛋白Tarp、CT694和CT166通过调节宿主细胞肌动蛋白骨架促进Ct入侵。

Dumoux等[8]研究表明IPAM可募集并刺激中心体蛋白170(CEP170)重塑微管(MT)网络。MT参与胞内运输和维持细胞结构，是细胞骨架的重要组成部分，CEP170是维持包涵体形态、产生感染性子代所必需的蛋白。另有研究表明，在Ct感染的细胞中，F-肌动蛋白(F-actin)聚集在包涵体周围，对维持高尔基体形态有重要作用[9]。通过干扰肌动蛋白聚合以及对比分析InaC突变株和野生株的性状，发现InaC参与F-actin在包涵体周围的积累。InaC还可募集ADP核糖基化因子1 (ARF1)和ARF4到包涵体膜并调节二者的激活，诱导MT翻译后修饰，从而促进包涵体周围高尔基体的重定位[10]。

易位的肌动蛋白募集磷蛋白(TarP)、CT694及CT166都可调节宿主细胞肌动蛋白进而促进Ct侵袭。TarP是衣原体早期的多域效应蛋白，介导肌动蛋白的成核和成束。Tarp可招募肌动蛋白，包含几个与WH2结构域蛋白相似的C末端肌动蛋白结合域[11]；还包含一个富含脯氨酸的区域，可增强肌动蛋白的寡聚化。研究表明，酪氨酸磷酸化的Tarp结合并招募RAC1激活因子(Sos1和Vav2)，使TarP与Arp2/3复合物协同作用，提高肌动蛋白聚合速率并促进Ct侵袭[12]。Ghosh等[13]使用荧光报告等位基因交换诱变(FRAEM)技术，表明F-肌动蛋白(F-actin)结合域的C末端对Tarp介导的Ct入侵宿主细胞有重要作用。对TarP的研究通常集中在Ct蛋白的同源物。鼠衣原体(C.muridarum，Cmu)、豚鼠衣原体(C.caviae)和肺炎衣原体(C.pneumoniae，Cpn)中的TarP同源基因没有磷酸结构域，但均可招募肌动蛋白，表明Tarp的磷酸化区域不是肌动蛋白募集的必要条件[14]。易位膜相关效应蛋白A(TmeA)即CT694，由T3SS分泌并存在于EBs中。CT694不直接与肌动蛋白相互作用，而是与人AHNAK蛋白的重复区和C末端相互作用，并影响宿主细胞肌动蛋白应激纤维的形成[15]。使用FRAEM技术构建CT694突变株[16]， 表明CT694的缺失可导致小鼠感染率降低以及对宿主细胞侵袭水平下降。无论是否敲除AHNAK蛋白，CT694突变株对宿主细胞的侵袭均减弱，然而野生型Ct对宿主细胞的侵袭没有缺陷[17]，表明Ct有效入侵宿主细胞需要CT694，但与CT694和AHNAK的相互作用无关。TarP和CT694是目前与侵袭相关最具特征的效应蛋白，另有CT166也具有同样的作用。CT166只存在于Ct生殖生物型，与艰难梭菌毒素的葡萄糖基转移酶(GGTs)的N末端具有同源性[18]。使用高感染复数(MOI)的沙眼衣原体D型感染宿主细胞，可导致宿主细胞变圆和肌动蛋白重组，这可能下调RAC1介导的信号从而导致衣原体侵袭所需的宿主细胞肌动蛋白骨架变化[19]。

2.2影响宿主细胞免疫反应 衣原体感染宿主细胞会产生多种效应因子，使宿主产生免疫反应。目前已证明Inc蛋白Cap1(CT442)和CrpA(CT529)刺激机体产生适应性免疫反应，CT143刺激促炎因子分泌，非Inc蛋白TepP调节宿主细胞固有免疫信号。

易位早期磷酸化蛋白(TepP)即CT875，是Ct感染早期分泌最丰富的效应蛋白。Tarp、CT694和TepP均与T3SS伴侣蛋白-SycE样伴侣1(Slc1)相互作用并促进分泌，被传递到宿主细胞质后定位在新生包涵体附近[20]。TepP一旦转移到宿主细胞，便在多个酪氨酸和丝氨酸残基处磷酸化。研究表明，TepP可通过四肽重复序列1(IFIT1)和IFIT2下调IFN诱导蛋白的表达[21]。Carpenter等[22]研究表明TepP对宫颈上皮细胞中衣原体的复制、I型IFN基因的激活以及I类磷酸肌醇3激酶(PI3K)和CrkL向新生包涵体的募集具有重要作用。虽然TepP是Src激酶酪氨酸磷酸化的靶点，但这些修饰似乎不影响PI3K或CrkL的募集。TepP的易位与细胞内磷酸肌醇(3,4,5)-三磷酸的增加有关，而与生存前激酶Akt的激活无关[22]，提示TepP介导的PI3K激活仅限于包涵体早期。总之，Ct可通过TepP限制PI3K来调节细胞信号通路和膜转运，抑制INF的产生，从而在感染早期颠覆宿主细胞固有免疫，这可能是衣原体生长所必需。Inc蛋白Cap1和CrpA可引起机体产生保护性免疫，同时二者均可被MHC I类分子提呈给CD8+T细胞，刺激机体产生适应性免疫反应，从而促进感染小鼠体内Ct的清除[23]。CT143可通过激活THP-1细胞中的p38/MAPK信号通路刺激促炎因子分泌，这与Ct感染过程中的炎症反应有关[24]。

2.3调节宿主细胞囊泡和非囊泡运输 由于Ct缺乏所需的生物合成酶，因此需要与各种宿主途径进行复杂的相互作用来获取鞘磷脂、胆固醇和甘油磷脂等，包括囊泡运输和非囊泡运输途径。囊泡运输可通过宿主可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着受体(SNARE)蛋白的募集来调节，是细胞内融合机制的关键组成部分。至少有3个Inc蛋白(IncA、IPAM和InaC)含有SNARE基序，它们能够像SNARE蛋白一样发挥作用从而抑制囊泡融合。其中，IncA的SNAREs样结构域(SLD-1)和SLD-2可抑制二者介导的内吞性膜融合，从而避免包涵体与有害囊泡融合[25]。此外，IncE可与逆转运复合体中的SNX5和SNX6结合，调控宿主的逆向囊泡转运，使Ct感染性子代增加[26]。Rab GTPases也是控制真核细胞囊泡运输的主要因素。Faris等[27]证明CpoS靶向多个Rab GTPases及其同源效应蛋白至包涵体，并且拦截来自循环途径的宿主囊泡，从而调节转铁蛋白和甘露糖-6-磷酸受体(CI-M6PR)的转运。它们的活性对于Ct摄取营养、避免包涵体与溶酶体融合和稳定包涵体膜具有重要作用。

目前已知Inc蛋白IncD和IncV参与非囊泡运输。Ct可通过包涵体与内质网形成的膜接触位点(MCS)获取脂质。神经酰胺内质网转运蛋白(CERT)是MCS的功能性成分，参与神经酰胺从内质网到高尔基体的转运。然后经鞘磷脂合酶2(SMS2)将神经酰胺转化为鞘磷脂，鞘磷脂对Ct的生长至关重要[28]。研究表明，IncD可与CERT相互作用并将其招募至内质网-包涵体MCS处，从而调控宿主细胞非囊泡运输[29]。CERT中的FFAT基序介导了其与VAMP相关蛋白A(VAPA)和VAPB的相互作用，间接导致VAPA/B的募集。VAPA/B在包涵体周围的募集也与IncD相关。IncV同样可与VAPA/B的相互作用[30]，这种相互作用依赖于IncV所含的FFAT基序。IncV是建立内质网-包涵体MCS的重要因素，但不是唯一因素，提示还有其他分子参与此过程。

2.4参与染色质的重塑 目前已发现非Inc蛋白NUE和CT460参与染色质的重塑。蛋白质核效应因子(NUE)是含有SET结构域的衣原体蛋白，此结构域主要存在于控制基因表达和染色质结构的真核细胞组蛋白甲基转移酶中[31]。体外甲基化实验证明NUE能够使组蛋白H2B、H3和H4甲基化，可能参与染色质的重塑。CT460是最新发现的T3SS效应蛋白，含有一个可能参与染色质重塑的SWIB/MDM2结构域。研究发现，该蛋白与嗜线粒体华诊体(Waddliachondrophila)蛋白Wcw_0377同源，并且具有相同的SWIB/MDM2结构域[32]。SWIB/MDM2结构域主要存在于真核生物，可到达宿主细胞核从而与宿主细胞蛋白相互作用[21]，表明含有该结构域的蛋白可能与宿主细胞的相互作用有关。Kebbi-Beghdadi等[32]证明CT460与NUE相似，定位在感染细胞的细胞核中并在染色质重塑中发挥作用。

2.5调控衣原体EBs的产生及释放 衣原体可通过细胞裂解或挤压的方式将EBs从宿主细胞释放。溶解释放导致宿主细胞死亡，涉及半胱氨酸蛋白酶及细胞质膜的破裂；相反，挤出过程使宿主细胞保持完整，宿主细胞膜收缩然后排出EBs。现已发现，Inc蛋白CT228、MrcA和非Inc蛋白CT622参与此过程。

CT622可调控EBs的产生。研究表明，CT622可被T3SS抑制剂N′-4-硝基苯并酰肼阻断[33]。Cossé等[34]证明CT622基因表达的缺失可导致Ct生长缺陷，构建CT622突变株表明EBs减少，这与Ct侵袭宿主细胞和EB-RB转化的缺陷有关。通过X射线晶体学测定了CT622 C末端的三维结构，揭示了其与香叶基转移酶(GGTases)和合成酶具有结构相似性[35]。挤出过程需要肌动蛋白聚合及RhoA、神经性Wiskott-Aldrich综合征蛋白(N-WASP)、肌球蛋白II和肌球蛋白磷酸酶途径的组成部分，如肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(MYPT1)。Lutter等[36]证明CT228与MYPT1相互作用并将其招募至包涵体周围微区，调节EBs的挤压释放。MYPT1介导的肌球蛋白轻链II(MLC2)磷酸化有利于挤压释放，而MLC2的缺失或去磷酸化有利于溶解释放。Nguyen等[37]确定了MrcA与Ca2+通道肌醇1,4,5-三磷酸3型受体(ITPR3)之间的相互作用，并证明Ca2+信号通路参与EBs释放的调节。Ca2+的增加可以促进MLC2的磷酸化激活肌球蛋白II活性，从而促进EBs的挤压释放。最终，原始细胞的完整可防止炎症物质释放，保护EBs免受宿主细胞免疫，从而促进感染的持续。

2.6调控宿主细胞凋亡 Ct为维持其完整的发育周期，在Ct复制的早期阶段通过抑制促凋亡途径和激活促存活途径抑制细胞凋亡，在复制的中后期则诱导细胞凋亡使其得以繁殖。沙眼衣原体 T3SS效应蛋白在此过程中发挥了重要作用。现已发现，沙眼衣原体 Inc蛋白中的CpoS、IncC 和 CT383抑制宿主细胞凋亡，非Inc蛋白CADD参与宿主凋亡机制从而促进细胞凋亡。

Sixt等[38]证明Cpos通过与GTPaes Rab4分子相互作用靶向干扰素基因刺激因子(STING)，抑制宿主细胞过早死亡以利于包涵体在宿主细胞内完成发育周期。包涵体的过早破裂可导致自噬体的识别、内在凋亡的激活以及衣原体发育周期的过早终止。Weber等[39]通过inc基因的插入诱变，证明CpoS、IncC和CT383在维持包涵体膜稳定性方面起着重要作用。它们的缺失导致包涵体不稳定，细菌及其细菌成分释放到胞浆中从而导致宿主细胞死亡增加。衣原体蛋白相关死亡结构域(CADD)在Ct感染的晚期表达[40]，与肿瘤坏死因子(TNF)受体共同定位于包涵体附近。CADD与TNF受体家族TNFR1、Fas、DR4和DR5的死亡域相互作用，但不与相应的下游衔接因子相互作用。并且CADD能够结合多种含有TNF受体的死亡结构域，在瞬时转染到各种哺乳动物细胞系时以caspase依赖的方式诱导细胞凋亡[41]。它的凋亡诱导作用可被caspase抑制剂阻断，提示其通过参与宿主凋亡机制促进细胞死亡；表明CADD可调节感染细胞的凋亡途径，揭示了宿主与病原体相互作用的新机制。

3 总结与展望

T3SS作为衣原体与宿主细胞重要的连接媒介，是有力的抗毒力靶点。大约10%的衣原体基因组编码T3SS效应蛋白[42]，从而使Ct有效侵袭宿主细胞、获取营养和逃逸固有免疫反应。目前对T3SS效应蛋白的功能有了一定的了解，但迄今为止尚未阐明所有功能。例如，对于调控衣原体EBs释放机制的了解甚少。由于Ct的生存和增殖依赖于效应蛋白的选择性相互作用，因此对Ct更广泛的了解将是设计或优化抗菌药物的有力工具。幸运的是，最近分子遗传学的发展使科学家更深入地分析Ct的感染生物学。通过研究Ct的发病机制和生命周期对Ct的预防和治疗有重要的科学意义。

利益冲突：无