蜜蜂卫生行为研究进展及应用前景

任勤 罗文华 曹兰

（重庆市畜牧科学院，荣昌 402460）

社会性群体生活的昆虫已经进化出了集体免疫防御系统来抵御病害。这些“社会免疫系统”是群体成员合作对抗因社会性和群体生活而增加的疾病传播风险的结果[1]。社会性免疫防卫是蜂群群体抵抗外界病害的重要行为机制，其中的卫生行为就是蜂群抵御外界病敌害的有效机制之一，蜂群的这种行为能够消除或者减少病害的传播，一定程度上还能使得染病蜂群自愈。因此，本文就蜜蜂卫生行为过程、影响因素、评价方法等进行了综述。

1.蜂群的卫生行为

蜂群的卫生行为就是工蜂能够定位含有感染或者死亡的幼虫巢房，打开它们并去除巢房中死亡幼虫或蛹的行为过程[2-5]。这种行为也被定义为工蜂清除蜂群内任何发现的其他异物的过程[6]。Rothenbuhler 在1964年首次描述了这一行为过程[3]，Moretto 于1993年引入了卫生行为的概念[6]。蜂群的卫生行为可分为两步进行描述，首先蜜蜂监测到染病虫的位置，进行巢房蜡盖的穿孔，其次，进行打开巢房蜡盖和清除染病幼虫的行为反应。蜂群的卫生行为是个体工蜂的一种遗传特征，它赋予了群体水平抵抗各种疾病的能力。单只蜜蜂并不能完成打开巢房和清理巢房的一系列卫生行为，此时，另外一只蜜蜂可能扩大巢房孔面积，然后，第三只蜜蜂执行清出染病虫[7]。

卫生行为对蜜蜂种群动态非常重要，因为它可以避免或者阻碍疾病的发展，被认为是抵御美洲幼虫腐臭病、欧洲幼虫腐臭病、白垩病等疾病的主要防御措施[3,8,9]。具卫生行为的蜂群对其他寄生物也具有相同的抵抗能力，如打开和移走被蜂螨感染的病虫，干扰蜂螨的正常繁殖，减少了螨害的发生等[10]。具卫生行为的蜂群还可以减少蜂产品和巢脾蜂蜡中真菌孢子的数量[11]。

对于单只蜜蜂，抗病行为与细胞和体液免疫反应属于同一个类型，两者均涉及监测与识别外来病原或寄生物，随后启动了适当的免疫反应。在社会性免疫反应中，卫生行为的蜜蜂具有特定性，如监测和移走巢内染病幼虫或被寄生的幼虫，这正是蜂群耐受疾病的潜在机制。卫生行为的蜂群能够监测巢脾内存在病虫或不健康虫态，然后适当刺激个体蜜蜂及时移走感染早期的病虫[12]。

2.影响蜂群卫生型的因素

2.1 遗传基础

研究证实，卫生行为的遗传基础基于几个基因的控制，是一种调控极其复杂的行为方式。Rothenbuhler研究认为卫生行为是由两对隐形基因（u = uncapping 和r = remover）控制，包括打开行为（u）和移走行为（r），当它们是纯合子时，蜜蜂才表现出卫生行为[3]。Moritz重新评价了Rothenbuhler’s 结果，认为遗传机制更复杂，提出了一个三基因模型，其中纯合性中的一对基因（u）负责打开巢房，而两对基因（r1 和 r2）负责移走病虫，然而，这一假设尚未得到证实[13]。Gramacho等强调蜜蜂穿孔巢房蜡盖的行为，并提出了三个隐形位点的模型，包括隐性位点控制穿孔和打开行为（u1和u2），另外一个位点（r）控制蜜蜂移走幼虫的行为[14]。现代遗传分析表明，卫生行为是由许多基因以复杂的方式控制的。Lapidge 利用现代分子技术和数量性状位点（QTL）提出了七个位点可能影响卫生行为[15]，卫生行为以数量性状位点而非孟德尔定律进行的遗传。

蜜蜂执行打开和移走染病幼虫，蜂群之间存在明显变化，例如卫生行为的蜂群中执行打开和移走行为，而非卫生行为的蜂群未能及时清除病虫，导致病害发生严重，这些均是受到数量性状位点的控制[16]。Robinson 等提出工蜂维持蜂群或移走病尸，从事社会性清理行为或交哺，具有明显的父系遗传或亚家族特点，并提出基因型和遗传特征影响蜂群的劳动力分工[17,18]。

2.2 嗅觉感知

嗅觉感知和刺激处理对于确定单个蜜蜂是否具有卫生行为很重要。研究发现，卫生基因型的蜜蜂和非卫生基因型的蜜蜂对健康和患病幼虫气味有不同的感知。Masterman 等研究发现，与非卫生行为蜂群相比，卫生行为蜂群能够更好地区分健康和患病蜂群的气味，并得出结论，卫生行为和非卫生行为的蜂群具有不同的嗅觉敏感性[19,20]。Katia 通过对蜂群的选育研究发现这种嗅觉灵敏性的存在，并且染病幼虫散发的气味介导产生相应的卫生行为[21]。

Katia 等得出基因型并非是影响卫生行为的关键因子，而嗅觉灵敏性、行为反应和嗅觉刺激的强度是影响卫生行为的关键因素[21]。通过吻伸反应和触角电位反应得出嗅觉灵敏的15～20日龄工蜂具有明显的打开和清理巢房行为，有效的区分健康虫和病虫，该日龄的工蜂对特征性物质具有明显的吻伸反应，触角电位结果得到相似的结果。蜂群的卫生行为，归咎于灵敏的嗅觉和非健康幼虫的挥发性物质刺激[21,22]。

Jodi 等经过通过气质联用技术对工蜂感染蜜蜂幼虫的真菌-球囊菌后检测鉴定出来感染的幼虫释放三种挥发性物质成分，苯甲醇、苯乙醇、乙酸苯乙酯。三种物质只出现在白垩病感染幼虫的挥发性物质中，并未出现在健康幼虫的挥发性物质中。通过两种蜂群方法揭示出其中乙酸苯乙酯是关键的一种物质，该物质是感染球囊菌的幼虫释放并且诱导产生蜜蜂执行卫生行为的物质[23]。嗅觉灵敏性强的蜂群，并且健康和染病幼虫存在一定浓度的差异性挥发性物质，有利于启动打开和清除病虫的卫生行为。

2.3 其他因素

虽然卫生行为具有很强的遗传成分，但它是一种复杂的社会特征，必须在群体或群体环境中考虑其表达。卫生行为主要由15～20日龄以下的中年工蜂执行[7,24]，因此，基因型—年龄相互作用在卫生行为的表达中很重要。尽管如此，在外界流蜜好的时候，年龄较大的蜜蜂也可以被诱导表达这种行为[24,25]，这可能是由于蜂群内部空间的可利用性变化引起，表明基因型—年龄—环境相互作用也参与了卫生行为性状的表达。卫生行为的表现也取决于蜂群的强弱，当具卫生行为蜂群群势变弱或工蜂数量减少时，卫生反应显著降低[4]。Message等研究认为卫生行为是高度可变的，并受湿度和温度等气候条件以及蜂群条件的影响[26,27]。

以上研究说明，该性状的表达是兼性的，不仅取决于个体工蜂的基因型，还取决于群体内工蜂的年龄构成、蜂群的强弱、外界蜜源条件和可用性、蜂群内部空间需求、特定疾病或病原体的存在以及成年工蜂对特定疾病或病原体的生理抵抗程度。

3.蜂群卫生行为评价方法

大量的研究结果证实了死亡幼虫去除率与蜂群对幼虫疾病的抵抗力之间的关系。在这种情况下，建立一种有效的卫生行为评价方法变得至关重要。在大多数关于蜜蜂卫生行为的研究中，蜂群并没有出现病虫害，取而代之的利用接种或者杀死幼虫的方法来进行的。

早期对蜜蜂卫生行为的研究是利用给幼虫接种细菌，然后通过观察蜜蜂检测病虫和清除过程来进行，然后计算蜜蜂对病虫的清除率以确定蜂群的卫生行为能力[3,28,29]。

Taber 等利用冷冻的方法对蜂群的卫生行为进行了研究[30-33]。在冷冻方法中，一种是将包含100 个巢房的巢脾切下来，然后放到-20℃至-18℃的冰箱中冷冻至少24 小时，然后将其放到原蜂群位置进行测定清除率；另一种方法就是液氮冷冻，利用自制的柱状塑料体，置于封盖子脾上，然后倒入液氮冻死幼虫来测定蜂群在特定时间内的清除率。以上两种冷冻方法中，使用液氮冷冻被认为是最保守和可靠的评价方法[32,33]，因为相比切割冷冻，液氮冷冻对巢脾的破坏较小。

Newton 等通过针刺的方法对蜂群卫生行为进行了评价[34-36]。利用昆虫针自制针刷（包含100 个针）对封盖子进行针杀处理，然后测定蜂群清除能力。Bekesi 和 Szalai 建议使用针刺测试（针杀幼虫），Palacio 等人也使用了这种方法。Spivak 等比较了针杀和冷冻方法，发现应用针杀方法时，蜜蜂迅速检测到被杀死的幼虫并进行清除，与冷冻方法发生的情况相反，表达虚假卫生特性的蜂群数量增加了，因此，他们并不认为穿刺技术是可靠的。

Olszewski 等利用针刺法作为比较，测试了蜂群清除碎纸片的能力[37]。他们将碎纸片放在巢脾之间，然后在特定时间内测量纸片的重量。通过对比他们发现，两种类型测试之间的相关性为正切显著，因此，他们认为通过碎纸片清除来测试蜂群卫生行为是可行的，可以作为评价蜂群卫生行为的一种方法。

利用以上方法测定蜂群卫生行为时，蜂群能在24～48 小时清除死亡幼虫或者碎纸片达到90%～95%以上时，才认为这个蜂群是具有卫生行为的[31,33]。

4.展望

蜜蜂卫生行为首先是作为一种控制美洲幼虫腐臭病的潜在机制备受关注[38,39]。尽管卫生行为不是蜂群抵抗各种病害的唯一机制，但其仍然是抵抗各种病害的主要机制[5,9]。Trump 等研究发现，卫生行为是蜜蜂与生俱来就有的[40]。而且蜂群之间卫生行为的表达是可变的，这种性状表达可通过选择增加，这就说明基因型在卫生行为的表达中起重要作用。因此，卫生行为的遗传模式和影响该性状的基因数量就成为研究的核心。

尽管通过常规的评价方法再结合人工授精或者隔离自然交尾进行选择育种，可以成功的选育出具卫生行为的蜂群[41]，但利用这种传统的选育方法费时费力，因此，需要更准确地确定有多少个位点直接影响卫生行为，开发出鉴定卫生行为的分子方法。

使用化学药物防治病害有其问题和局限性，一是长期使用使得药物有效性下降，二是各种病害对药物的抗性提高，三是使用化学药物防治增加了产品污染。因此，解决蜜蜂病害问题的唯一可行的方法就是鉴定和培育具有抗性的蜜蜂种群，并通过选择、培育来增强它们对该病的抵抗能力，这可以通过刺激蜜蜂卫生行为来获得[42,43]。

重组 DNA 技术和分子技术，如聚合酶链反应已经彻底改变了行为遗传学的研究。传统上，对遗传性状的研究仅限于对形态特征和表型的观察和分析。今天，遗传模式和性状的潜在遗传机制可以在 DNA 水平上进行研究，这使得对复杂行为特征的遗传研究能够达到一个新的水平。使用分子技术可以更准确地确定基因组内的数量、位置和直接影响蜜蜂卫生行为基因的相对影响水平。因此，开发出可靠的分子标记诊断方法，用于快速有效的识别具有卫生行为的蜂群，就是目前研究的主要目标。然后将其用于选择育种，增强蜂群卫生行为的表达能力，作为控制各种病害的自然而有效的机制。