牙龈卟啉单胞菌对不同组织来源血管内皮细胞的作用及机制的研究进展

雷双 庾靖君 唐晓琳

1.中国医科大学口腔医学院·附属口腔医院儿童口腔科 辽宁省口腔疾病重点实验室 沈阳110001；2.中国医科大学口腔医学院·附属口腔医院牙周病科 辽宁省口腔疾病重点实验室 沈阳110001

牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是重要的牙周可疑致病菌，是1 种革兰阴性专性厌氧杆菌，在牙周组织附着严重丧失部位、深牙周袋部位检出率较高。根据第四次全国口腔流行病学调查报告，牙周病作为口腔中常见病、多发病，发病情况呈现上升态势[1]。现有研究发现，P.gingivalis不仅与牙周病密切相关，而且与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）[2]、阿尔兹海默病（Alzheimer's disease，AD）[3]、帕金森疾病（Parkinson's disease，PD）[4]等多种全身性疾病关系密切，可能是加重疾病发生发展的重要原因之一[5]。根据全基因组关联分析（genome‑wide association study，GWAS）研究，P.gingivalis感染条件下的失调宿主基因在AD 等认知障碍疾病、糖尿病、心血管疾病等宿主基因中富集；此外，牙周炎组织或P.gingivalis感染巨噬细胞中失调基因与AD海马组织或粥样硬化斑块中的失调基因相类似，说明牙周炎可能是全身疾病的致病因素之一[6]。有学者[7]采用多种口腔致病菌共同感染Toll 样 受 体（Toll like receptors，TLR） 2‑/‑和TLR4‑/‑双敲除小鼠后，发现在心脏、肾脏、肺、动脉等器官中检测到口腔致病菌基因组DNA，提示口腔致病菌可以向全身组织器官内播散。

血管内皮细胞（endothelial cells，EC）位于血管内壁，有利于血流移动，血小板功能及免疫功能。微生物利用宿主循环系统在体内循环，通过EC 进出血流。细菌等危险因素暴露可损伤内皮细胞的防御机制，导致血管内皮细胞完整性破坏，引起血管内皮细胞功能失调[8]，同时，内皮细胞中的某些基因将被激活并改变细胞的功能特性[9]。病原菌会促进EC 衰老、凋亡并干扰其生物学屏障。本文就P.gingivalis 对不同组织来源血管内皮细胞的可能作用及机制作一综述。

1 P.gingivalis对外周心血管EC的作用研究

心血管疾病是一系列由遗传和环境共同作用而引起的多因素慢性炎症性疾病。根据世界卫生组织的定义，心血管病是心脏和血管疾患引起的，包括冠心病、脑血管疾病、高血压、周围动脉血管疾病、风湿性心脏病、先天性心脏病和心力衰竭。应用核酸及抗原检测方法在人类AS斑块中已鉴定出多种病原体，包括肺炎衣原体、幽门螺杆菌、肠杆菌及多种口腔致病菌如P.gingivalis等，提示细菌可能是参与AS 的重要致病因素之一[10]。在动物实验中发现，应用P.gingivalis脂多糖（li‑popolysaccharide，LPS） 感 染 载 脂 蛋 白E 基 因（ApoE‑/‑）敲除小鼠构建疾病模型，发现由重度牙周病诱发的系统性炎症会加速AS的形成，诱发内皮细胞功能紊乱并激活巨噬细胞[11]。以上结果说明，P.gingivalis感染与AS 关系密切，P.gingivalis与血管内皮细胞相互作用是AS斑块形成和内皮细胞功能紊乱的重要病理基础。

1.1 P.gingivalis与EC相互作用的毒力因子

P.gingivalis是牙周病的主要致病菌，其菌毛、荚膜多糖、LPS、胶原酶、牙龈蛋白酶、凝血素、脂蛋白等会损伤血管内皮细胞功能，诱发炎症反应，从而引起AS。细菌菌毛蛋白fimA 作为细菌表面主要毒力因子，有学者[12]检测AS 斑块样本中不同fimA 基因型，发现fimA Ⅳ型、Ⅱ型检出率明显高于其他类型。LPS 作为P.gingivalis主要毒力因子，可通过调节肌动蛋白激酶1/2途径激活血管内皮细胞诱导血管生成[13]。有学者[14]将人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells，HCAEC）分别持续暴露于P.gingivalis及其毒力因子LPS 中，发现其诱发促炎因子及血管紧张素Ⅱ的形成，从而导致内皮功能紊乱，可能是AS 发生、发展的原因。另外，P.gingivalis脂蛋白[15]、牙龈蛋白酶[16]、血凝素A（hemagglutinin A，HagA）[17]等参与其对内皮细胞的黏附和侵入过程，加速AS发病过程。

1.2 P.gingivalis对EC的黏附和侵入

细菌对EC 的黏附及侵入在细菌致病过程中具有重要意义，细菌的致病前题是其黏附于特定组织表面。P.gingivalis侵入人脐静脉的内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）系中，诱导核苷酸结合的寡聚糖结构域过表达，促进血管细胞黏附分子1（nucleotide‑binding oli‑gomerization domain 1，NOD1）及细胞间黏附分子表达，沉默NOD1 后抑制NF‑κB 通路，在细菌侵入EC 中发挥重要作用[18]。巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）在P.gingivalis入侵EC中促进黏附分子1表达。内皮细胞表达MIF，诱导的促AS 病损形成[19]。另有研究发现，P.gingivalis可表达多种血凝素作为毒力因子参与对内皮细胞的黏附及侵入，HagA 可黏附、侵入HCAEC及牙龈上皮细胞（gingival epithe‑lial cells，GEC）等多种细胞[17]。还有研究发现，P.gingivalis通过CD74/CXCR4 受体复合体调控单核内皮细胞黏附过程[20]。但具体作用机制仍需进一步探究。

侵入是细菌致病并使其深入内部的另一种重要方式。牙龈蛋白酶在P.gingivalis侵入多种细胞中均发挥重要作用[16,21‑22]。P.gingivalisW83 侵入冠状动脉内皮细胞时，脂蛋白PG0717表达升高，同时PG0717缺失可降低牙龈蛋白酶的活性，说明其可能参与P.gingivalis的毒力作用，参与内皮细胞中P.gingivalis的清除和感染控制[15]。研究发现，P.gingivalis381能够入侵内皮细胞，细菌避开了溶酶体的内吞途径，而是在自噬体中存在，持续影响内皮细胞从而形成慢性感染可能会加剧沿血管部位的免疫应答[23]。近年来研究发现，相比于使用细菌毒力因子，直接采用细菌侵入对内皮细胞损伤更大。学者应用不同菌株P.gingivalis（W83、A7436、381、33277）感染ApoE‑/‑AS 小鼠，评估其对人冠状动脉内皮细胞侵袭、黏附能力，发现W83、A7436、381 侵袭能力强于33277，说明不同菌株对内皮细胞的侵袭作用及其潜在机制存在差异[24]。

1.3 P.gingivalis促进EC凋亡

正常血管壁存在少量的细胞凋亡，对维持血管的正常发育必不可少，而AS时则会出现异常活跃的血管内皮细胞凋亡[25]。将牛冠状动脉内皮细胞（bovine coronary artery endothelial cell，BCAEC）暴露于牙龈蛋白酶中，会导致细胞黏附降低并且凋亡增加，并与不同水平的半胱氨酸依赖蛋白水解活性相关[16]。由P.gingivalis提取的蛋白酶样物质可诱导主动脉内皮细胞凋亡，可能机制为破坏微管蛋白及整合素β1、降低ERK1/2 蛋白激活[26]。Hirasawa等[27]发现，P.gingivalis感染HUVECs诱导内质网应激介导的细胞凋亡，随后自噬反应保护其细胞凋亡的影响，从而影响血管系统AS 的发生。

1.4 P.gingivalis诱导EC炎症反应

AS 作为一种慢性炎症性疾病，致炎因子在AS 的发病进程中发挥了重要的炎症调节作用。P.gingivalisfimA 通过上调gp130 表达，可诱导HUVECs 自分泌调节白细胞介素（interleukin，IL）‑6，诱发炎症反应[28]。选择素E 作为表面蛋白，参与调控P.gingivalis对HUVECs 黏附作用，并激活胞外分泌，可能激活血管炎症反应[29]。Suh等[30]发现，P.gingivalis‑LPS 可以促进全身炎症反应和AS斑块形成；P.gingivalisLPS通过上调内皮细胞黏附分子的表达，从而增加单核细胞对内皮细胞的黏附，并促进巨噬细胞产生炎症因子。

2 P.gingivalis对肾小球内皮细胞的作用研究

慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）是1种严重危害人类生命健康的常见慢性疾病。流行病学调查显示具有逐年升高趋势[31]。相比之下，CKD 人群罹患牙周病的风险更高[32‑33]，并且牙周病亦对CKD 的发生发展产生影响[33‑34]。目前，很难确定牙周病在CKD致病机制中的具体作用。EC作为肾组织内主要组成部分，研究表明EC 损伤可能是细菌及其毒性产物引起宿主免疫反应的重要机制。

目前，针对P.gingivalis对肾小球血管内皮细胞的研究较少。Harada 等[35]应用P.gingivalis‑LPS刺激小鼠肾脏，检测其基因表达谱，发现在5 个功能性基因差异表达，同时，体外实验中在肾小球内皮细胞也证实以上基因表达上调。以上结果提示，P.gingivalis‑LPS 刺激后肾组织内基因改变主要来源于肾内皮细胞，以上基因可能与CKD 的发病机制相关。Sawa 等[36]也发现，血液中TLR 受体诱导肾小球内皮细胞产生肿瘤坏死因子‑α、IL‑6等炎症因子，导致肾小球硬化症，提示P.gingivalis‑LPS 在糖尿病肾病中发挥重要作用。Kajiwara等[37]发现，在Ⅰ型、Ⅱ型糖尿病中肾小球内 皮 细 胞 表 面 存 在TLR‑2 及TLR‑4 受 体，P.gingivalis‑LPS 可降低糖尿病小鼠的生存率，其诱导糖尿病肾病主要依赖于肾小球内皮细胞中TLR2受体。

3 P.gingivalis对脑微血管内皮细胞的作用研究

血脑屏障（blood‑brain barrier，BBB）位于中枢神经系统实质内，由脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）及其细胞间的紧密连接、基底膜、及星形胶质细胞组成，调节离子、氧气及营养物质在血液和脑实质之间的交换。BBB 是外周微生物进入颅内的第1 道屏障。有学者[38]认为，BBB 干扰是AD 的早期指标，BBB功能受损有利于微生物进入中枢神经系统内。流行病学调查结果显示，慢性牙周炎患者患AD、PD 的危险因素更高，临床症状更显著[39‑40]。实验研究发现，P.gingivalis及其毒力因子诱发脑内炎症反应能够产生中枢神经损害，从而促进疾病发展[41‑42]。P.gingivalis可通过多种途径进入脑内，其主要途径为：1）感染巨噬细胞[43]；2）通过感染颅神经进入脑内（例如嗅觉神经）[44]；3）直接感染损伤BBB 中内皮细胞[45]。但目前对P.gingivalis如何影响BBB 及BMECs 功能研究较少。现有研究显示，慢性P.gingivalis感染可加速ApoE‑/‑小鼠脑组织中颗粒沉积，并且在脑毛细血管内可见广泛IgG 分布，免疫组化染色可见BBB 损伤，提示损伤的BBB 可能加重炎症反应从而加速老年鼠脑组织中颗粒沉积[46]。在P.gingivalis感染ApoE‑/‑小鼠大脑中发现，神经母细胞瘤细胞系表面膜结合的CD14受体脱落，内皮细胞之间紧密连接蛋白缺失，内毒素渗透通过BBB，导致脑组织暴露于炎症介质中[5]。有学者[47]认为，对于ApoE‑/‑小鼠大脑，BBB 完整性受损可能是实验诱导脑内组织损伤的继发因素。但目前，对于中枢神经系统BBB 损伤的具体机制仍不清楚。

4 结论

综上所述，P.gingivalis与外周心血管内皮细胞、BBB、肾小球血管内皮细胞相互作用，进入全身器官组织内从而可能参与AS、AD、CKD 等全身疾病的发生和发展过程。P.gingivalis及其毒力因子致病性在AS及非中枢神经系统血管内皮细胞方面的研究较多，但在BBB 及中枢神经系统血管内皮细胞方面鲜见报道。AD、PD 等神经退行性疾病在老年人中发病率较高，BBB 的病理变化在其中发挥重要作用，因此对于P.gingivalis对内皮细胞的作用及在各类神经系统病变过程中的作用机制应该给予更多的关注。对于P.gingivalis与BMEC 之间的具体作用机制报道较少，将来可通过转录组学和蛋白质组学高通量分析，结合生物信息学，筛选P.gingivalis发挥黏附作用的毒力因子及BMECs受体分子，有助于进一步确定细菌与BMECs之间具体作用机制。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。