双生子模型在唇腭裂病因学研究中的应用
2021-03-28马晓芳黄永清石冰马坚
马晓芳 黄永清 石冰 马坚
1.宁夏医科大学口腔医学院 银川 750003;2.宁夏医科大学总医院口腔颌面外科 银川 750004;3.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院唇腭裂外科 成都 610041
唇腭裂(cleft lip with or without cleft palate,CL/P)是最为常见的先天性颅颌面部畸形之一,全球发病率约为1.7/1 000,其发病率在地理区域、种族上有较大差异[1]。我国是CL/P的高发地区,每年有超过4万个CL/P患儿出生[2],且我国西部地区CL/P的发病率明显高于全国其他地区[3]。该畸形引起的骨组织缺损及软组织畸形,不仅影响患者的面容、喂养、语音、人际交往及心理健康,而且造成巨大的社会经济负担[4]。
根据是否伴有其他部位或器官的先天性畸形,唇腭裂可分为非综合征型(non-syndromic cleft lip with/without palate,NSCL/P)和综合征型(syndromic cleft lip with/without palate,SCL/P)。通常所提到的唇腭裂主要是指NSCL/P,约占70%[5],是临床上最为常见的类型。NSCL/P的遗传特征符合多因素阈值模式,遗传风险因素、环境暴露和潜在的基因-环境的相互作用均导致了疾病的易感性。大量双生子流行病学分析计算得出唇腭裂遗传度为70%[6-7],遗传因素是疾病发生的主因。
国内外对遗传因素的研究发现了10~20个易感基因或染色体区域与NSCL/P发病密切相关,然而在不同人群中验证所得结论一致性差,出现了较多分歧。因此,如何优化研究设计更为准确地定位NSCL/P易感基因成为唇腭裂遗传病因学研究的难点和热点。
SCL/P多符合孟德尔单基因遗传模式,病因较为明确。目前,包含CL/P表型的已知综合征超过600 多 种[1], 其 中 以 Pierre Robin 序 列 征 (Pierre Robin sequence,PRS)最为常见,其表型主要为小颌畸形、舌后坠、上呼吸道梗阻及腭裂[8]。研究[9-11]表明,Sox9基因、Med13l基因以及LAR家族磷酸酶基因Ptprs和Ptprf可能是PRS的易感基因。
为更深入地研究唇腭裂的病因,进一步解释唇腭裂不同表型的致病机制,双生子模型作为一种独特的流行病学设计,吸引着国内外研究人员的注意力[12-13]。本文就双生子模型在唇腭裂病因学研究中的应用与进展作一综述,以期为更深入地研究唇腭裂的病因提供新思路。
1 双生子的分类及鉴别
从胚胎发生过程的角度看,双生子有同卵与异卵之分。同卵双生子(monozygotic twins,MZ)是指由一个精子和一个卵子受精形成的受精卵完成第一次卵裂,形成的两个子细胞各发育成一个胚胎[14],理论上其应该具有完全相同的遗传信息,性别相同,表型特征也基本相同[15]。异卵双生子(dizygotic twins,DZ)则是由两个卵子分别与两个精子受精形成的两个受精卵,而发育成的两个胚胎[14],其共享基因仅约有50%[16],这与一般兄弟姐妹之间遗传相似度差别不大[14,16],所以其性别不一定相同,遗传信息与表型特征也仅在一定程度上相似[15]。在相比之下,DZ双生子的性别、血型、指纹、外观等表型特征常显示出明显的差异。
生活中,区分MZ与DZ双生子主要靠他们的身体特征,比如性别、面容、身材、声音等,也可以通过其性格、思维来判断,然而这些方法在严谨的科学研究中缺乏说服力。在已经应用的鉴别技术中,皮纹学是最古老的技术之一。大量的唇腭裂皮纹学研究发现,唇腭裂畸形与皮纹异常具有一定的相关性。
Harika等[17]对唇腭裂儿童父母的皮纹进行分析研究,发现与其健康父母及正常对照组相比,唇腭裂儿童的父母存在皮纹异常。他们选择400名年龄在25~45岁的符合纳入标准的父母,并将其分为2组,即A组由唇腭裂儿童的父母组成,B组由至少有2名健康儿童的父母组成。用墨汁法收集皮纹,对其指纹类型及掌纹进行分析。研究发现,A组和B组在指纹类型及掌纹上有明显差异(A组的皮纹研究参数异常,但是B组中没有表现出这些异常特征)。因此,唇腭裂与皮纹学的相关性研究将会给揭示唇腭裂畸形的遗传病因及开展唇腭裂疾病的预防提供重要的证据或线索。
Neiswanger等[18]随后进行了关于NSCL/P和皮纹类型的研究发现,NSCL/P个体、其未受影响的亲属或对照组在皮纹模式数量上没有明显差异。然而,用相异度评分来衡量,NSCL/P在其皮纹图案类型上明显比其未受影响的亲属或对照组有更多的皮纹不对称。此项研究样本量较大,是由NSCL/P病例(367例)、其未受影响的亲属(836例)和对照组(299例)组成的大型多种族队列,但是种族因素可能在一定程度上降低样本的影响力。
通过分析上述研究,笔者发现利用皮纹学进行双生子卵型鉴定,尤其是具有唇腭裂表型的MZ双生子,缺乏可信度。随着分子生物学技术的发展,基因诊断法成为卵型鉴定的金标准,其准确率达99%以上[19]。
微卫星DNA基因分型技术也称短串联重复序列(short tandem repeat,STR),是最为常见的一种基因诊断法,可以用来鉴别MZ和DZ双生子,但是无法对具有相同的基因组DNA序列的MZ双生子进行鉴别区分[20]。
随着现代分子生物技术的不断发展,以microRNA为主要分子标记的测序筛选成为鉴别MZ双生子新的手段[21-22]。研究[23]表明,在MZ双生子中,microRNA的表达存在差异。经芯片测序及相关验证发现并证实,miR-151a-3p、miR-3653-3p、miR-142-3p、miR-4325、miR-16-5p、let-7i-5p、miR-222-3p、miR-550b-3p、miR-4791和miR-27a-3p在MZ双生子中差异表达显著,以上10种microRNA可作为区分MZ双生子的生物标志物。不可否认,这一发现使得MZ双生子的鉴别变得更加精准,为后续利用MZ双生子进行遗传学研究提供了技术支持,以便研究者更加快捷地筛选研究对象。
然而,microRNA具有组织特异性[24],在对特定的疾病进行研究时可能是血液样本也可能是组织或其他类型样本,很难确定上述研究利用血液样本筛选出来的差异表达microRNA能否在组织或其他类型样本中表现出同样的差异表达。同时,上述10种具有生物标记作用的microRNA的功能还需进一步研究。
2 双生子模型的优势及用途
双生子因为享有相同的环境因素(包括子宫内环境以及发育期的环境暴露因素)且遗传背景相似[25],所以双生子最常被用来研究和评价复杂性疾病遗传病因及其对疾病的贡献度。对于唇腭裂这样的复杂性疾病而言,由于遗传异质性和环境因素的影响,使得绝大多数研究结果在不同的人群中验证结论不尽相同。因此,为了降低遗传异质性和避免环境因素的干扰,经典的双生子研究模型因其独特优势被选择。
利用双生子模型开展唇腭裂的病因学研究有三大优势[14]:1)MZ双生子可以在控制遗传效应的前提下研究环境暴露与唇腭裂发病的关系;2)DZ双生子可以在控制早期环境的前提下(共同抚养)研究遗传与唇腭裂发病的关系;3)MZ双生子(共同抚养)可以在控制遗传与环境因素的影响下研究复杂疾病的表观遗传机制[26]。表型不一致的MZ双生子可以最大程度地控制遗传和环境因素[14],因此可以作为研究唇腭裂的表观遗传机制的最佳模型。
双生子是一种很珍贵的研究资源,其仅占所有出生人口的0.5%~4.0%,不同种族和国家的比例有所不同[27-28]。收集双生子样本耗时较长,患有唇腭裂的双生子资源更是难得。由于双生子共享发育环境、具有相同的遗传背景,因此在实际研究中通常采用这样的研究策略,既可以选择小样本量的双生子做高通量测序筛选,然后针对筛选的分子标记或结果再进行大样本核心家系或病例对照等设计进行验证,这样就可以较为有效地解决双生子样本不足的难题。
双生子模型在遗传性疾病的病因研究中虽然优势出众,但是在实际研究中也存在一定的问题和缺陷,主要是以下3个方面。首先,双生子样本量较少,收集相对困难,留取的标本类型受限,尤其是MZ-A有畸形,MZ-B正常的双生子;其次,收集样本过程中家属常常不能提供是否是MZ,研究中需进行MZ与DZ的鉴别,否则不能控制DZ双生子的遗传效应造成的误差;再次,双生子测序样本量小,需要结合其他研究设计进行验证。以往的研究表明,进行唇腭裂的全基因组关联研究易感基因时,由于大部分采用的是病例对照设计,使得筛选的变异在人群中验证结果并不十分理想。然而,双生子模型的诸多优势可能会在唇腭裂遗传或表观遗传研究中有更大的价值。
3 双生子模型在唇腭裂病因学研究中的应用进展
3.1 双生子研究方法
19世纪有学者首次提出了双生子研究模型,认为双生子是可以用来评价先天和后天相对影响度的一个标准。20世纪双生子研究被广泛地应用于认识遗传和环境因素在复杂性疾病发生过程中的相对贡献,研究方法多是通过比较MZ和DZ双生子之间的一致率来确定遗传力,这些研究的基础是MZ双生子共享100%的遗传信息。
随着人类基因组计划的完成以及生物信息学等相关领域的不断发展与成熟,以全基因组关联分析(genome wide association studies,GWAS)为代表的组学研究在复杂性疾病的遗传学研究中的应用十分突出[29-30]。21世纪以来,随着现代分子生物技术的不断发展,分子生物学研究也开始广泛地被用于解释MZ双生子不一致之间的差异,结合全基因组测序方面的进展提高了这一研究领域的准确性。
Takahashi等[31]利用全基因组测序分析了一对具有镜像唇腭裂(MZ-A右侧显示唇裂合并腭裂,MZ-B左侧显示同样的缺陷)的4岁男性MZ双生子,其研究发现MZ-A与MZ-B的GRHL3和TPM1基因均异常表达,但是全基因组测序未能发现MZ-A和MZ-B存在不一致的DNA变异。由此,他们推测表观遗传变异是导致这对MZ双生子表现出镜像唇腭裂的原因。
双生子不仅是应用传统遗传标记进行疾病易感基因定位非常理想的研究样本,也是联系DNA拷贝数变异以及其他遗传标记与人类疾病相关非常珍贵的模型。双生子模型为复杂性疾病的表观遗传学研究提供了非常好的设计思路[16,32],并确认了一些基因或区域DNA甲基化或表观学变异与疾病的发生高度相关,如精神分裂症、自闭症谱系障碍、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等疾病。
近年来研究[33-34]表明,人肠道菌群与表观遗传存在一定的相关性,这些研究多集中在自闭症谱系障碍的表观遗传和肠道菌群之间的关系。Imamura等[35]在利用双生子模型分析遗传和环境因素对精神分裂症和自闭症谱系障碍的影响研究中提到肠道菌群的潜在影响可能是MZ双生子表型不一致的原因,而肠道菌群被归纳为环境因素,在DNA序列未发生改变的前提下,肠道菌群可能对MZ双生子的表观遗传变化发生潜在的影响。
目前,关于唇腭裂与肠道菌群的研究未见报道。笔者致力于唇腭裂病因学研究的初心是为了给揭示唇腭裂畸形的病因及开展唇腭裂疾病的预防提供重要的证据或线索,上述的研究思路为进一步探索唇腭裂的表观遗传机制提供了一个新的切入点,对唇腭裂儿童父母与正常对照组的肠道菌群进行关联研究或许可以会有新的发现。
3.2 表型不一致的单卵双生子
尽管MZ双生子在理论上拥有100%相同的遗传信息,但是关于表型不一致的MZ双生子的临床病案报道却是不胜枚举。Li等[36]报告了一对表型不一致MZ双生子(MZ-A表现为主动脉缩窄、左心室致密化不全、房间隔缺损、心包积液、左肾积水、中度发育迟缓,MZ-B表现为单脐动脉),对双生子及其父母进行染色体微阵列分析后发现,在这对双生子中位于16p11.2上均存在一个相同的244 kb微缺失,其中包括SH2B1基因。
此外,Takahashi等[31]报告了一对具有镜像唇腭裂(MZ-A显示右侧结构缺陷,MZ-B显示左侧同样的缺陷)的双生子,经全基因组测序后推测表观遗传是导致这对MZ双生子表现出镜像唇腭裂的原因。镜像唇腭裂是一种具有不对称表型特征的唇腭裂MZ双生子,约25%的MZ双生子可能具有镜像特征[15]。Gomes等[37]经超声检查发现了一对女性MZ双生胎儿的表型不一致(MZ-A正常,MZB表现为心脏发育畸形、右侧肺发育不全,呈马蹄形、右侧唇腭裂、右侧肾过小且位于盆腔内)。上述报道使得研究人员开始思考并且推测MZ双生子是否存在遗传学差异。
Jonsson等[38]发现,MZ双生子基因组序列也不完全相同,在胚胎发育早期就开始出现遗传学差异,这个时间点最早可追溯到受孕后的头几天至受精卵分裂瞬间。Jonsson等[38]为了评估MZ双生子的遗传学差异,对387对MZ双生子和他们的父母、配偶、子女的基因组进行测序,以确定他们的遗传突变是发生在体细胞还是生殖细胞。如果MZ双生子的突变只存在于一方,且其突变传到了下一代,那么就说明这个突变发生在双生子的生殖细胞中。研究[38]表明,这些突变在双生子的体细胞和生殖细胞中都有发现,而双生子胚胎发育期的原始细胞可同时产生生殖细胞和体细胞。受精卵在分裂的瞬间,细胞会随机被分配到双生子的两个早期胚胎中,这种早期胚胎发育中的细胞分配不均也可能是造成双生子遗传差异的主要原因。此外,Jonsson等[38]的研究结果显示,约15%双生子基因序列会存在不完全一致,有可能会产生不一致的遗传效应。MZ双生子基因序列不一致主要是因为胚胎发育早期原始细胞发生的大量突变,但是只有约15%双生子基因序列会存在不完全一致。因此,在同卵双生子研究中需要根据是否存在基因序列差异来制定研究策略。如双生子基因序列不一致,这些不一致的变异可能与某些表型相关联,寻找这些基因变异对探讨相关疾病的发病机制具有重要的意义,如双生子基因序列一致,可能需要从表观遗传等方面来着手研究。
譬如有专家说,多喝牛奶对人体有益,日本有“一瓶牛奶救活一个民族”的说法(指战后日本政府,每天在课间免费为中小学生提供一瓶牛奶)。因此,现在日本的年轻人,普遍比他们的父辈长得高大。
3.2.1 表观遗传学与表型不一致的单卵双生子研究 遗传信息相同的MZ双生子表现出表型差异的事实表明,非序列基础的因素——表观遗传,可能是导致MZ双生子表型不一致的一个不可忽视的原因[39-40]。
目前,大量的双生子表观遗传学研究表明MZ双生子存在表观遗传差异[41]。表观遗传是一种改变基因表达而不改变DNA序列的机制现象。表观遗传流行病学的主要焦点是DNA甲基化,这是一种最具特征性和最稳定的表观遗传修饰[40]。DNA甲基化是甲基被加到胞嘧啶或腺嘌呤上的过程[42],主要是通过破坏转录因子与基因5’端上游特定序列专一性结合并吸引甲基结合蛋白来影响基因表达,而甲基结合蛋白的主要功能是启动染色质压缩和基因沉默[40]。此外,胞嘧啶在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸区域的DNA甲基化是目前在人类群体中研究的最广泛的表观遗传现象[4,40]。
表观遗传变异与疾病表型有关[43]。通过量化MZ与DZ双生子全血DNA甲基化,Hannon等[40]发现,与DZ双生子相比,MZ双生子的DNA甲基化位点的特异性水平与表型的相关性更强。Alvizi等[44]使用全基因组关联研究对67名NSCL/P患者以及59名对照组进行DNA甲基化差异分析后发现了578个DNA甲基化位点与NSCL/P显著相关,且推测位于特定基因组位置的DNA甲基化是导致家族性或者非家族性NSCLP的原因。因此表型不一致的MZ双生子确实是表观遗传关联研究的优质模型[45]。
3.2.2 基因突变与表型不一致的单卵双生子研究在评估遗传与环境因素对人类群体的表型变异的影响力方面,MZ双生子是不可替代的研究资源[46]。例如一个受精卵分裂后形成两个早期胚胎,此后在MZ双生子中若只有一个胚胎在发育过程中形成唇腭裂,环境因素通常被认为是导致这种表型的主要因素。
研究[38]表明,MZ双生子的表型不一致可能是早期遗传突变导致的。基因突变导致的MZ双生子表型不一致在大量MZ双生子病例研究中得到验证。干扰素调节因子6(interferon regulatory factor 6,IRF6)基因[47]已被研究证实是Van der Woude综合征(Van der Woude syndrome,VWS)的致病基因之一。
VWS是SCL/P最常见的表型之一,占所有病例的2%。其中IRF6基因突变占VWS病因的70%,且这些突变大多数位于IRF6基因外显子3、4或蛋白结合域(外显子7~9)区域[48]。此外,研究[49]表明,GRHL3基因是第2个突变后导致VWS的基因,也证实了该综合征的基因座异质性。Schwartz等[50]通过全外显子组测序一对患有特异AT序列结合蛋白2(specific at sequence binding protein 2,SATB-2)相关综合征的MZ双生子(主要表现为腭裂、牙齿异常和发育迟缓),测序结果表明该对MZ双生子的SATB2基因发生了突变。
3.2.3 环境因素与表型不一致的单卵双生子研究除了遗传,妊娠期子宫微环境及母体身体状况也对MZ双生子的不一致产生影响。虽然MZ双生子在多胎妊娠中共用一个子宫,但他们不一定共用一个子宫环境。子宫内生长受限是双胎妊娠的常见问题,它经常导致出生体重的不一致[52],并与一系列表型的不一致有关[53]。子宫内生长受限导致MZ双生子不一致的潜在原因可能是遗传易感性、子宫内拥挤、卵裂时分配不均、血液供应不均以及胎盘功能障碍等[54]。
同时,母体的身体状况也对双生子的不一致表型产生影响,如妊娠期感染、流产史、孕前孕中服用药物、吸烟、饮酒、高血压及糖尿病史、接触稀土元素镧和钕等[55-57]。
虽然环境因素是导致CL/P畸形的另一大因素,但来自动物和人类实验的证据表明,当环境差异没有显著增加表型变异的程度时,遗传因素依旧是主要的影响因素,特别是表观遗传机制可以解释MZ双生子的不一致表型[58]。此外,基因与环境的相互作用也可能影响MZ双生子的表型。这种相互作用表现为两种危险因素的联合效应形成的协同作用或仅为两因素的叠加效应。由于个体的遗传倾向,基因与环境的相互作用对环境因素可能存在放大效应,例如一个人对某个特定的环境很敏感,那么由于个体敏感度,这个环境会对其产生更大的影响[59]。
双生子设计结合全基因组关联分析,弥补传统遗传学研究上的不足。随着分子生物学研究的不断发展,未来将在表观水平、信号通路领域上更加深入地探讨唇腭裂畸形的病因,希望可以为唇腭裂畸形的遗传病因研究及开展唇腭裂疾病的预防提供重要的证据或线索。
利益冲突声明:作者声明本文无利益冲突。