新型细菌检测工具在食品安全中的应用进展

2021-03-28贺强

质量安全与检验检测 2021年2期

贺强

（湖北省咸宁市公共检验检测中心湖北咸宁 437000）

1 前言

微生物种类繁多，广义上来讲，细菌就是微生物的一种，我们的日常生活离不开微生物。有些有益菌可以被人类利用，如利用酵母发酵酿酒，利用放线菌提取抗生素等等；有些致病菌则威胁人类健康，如葡萄球菌可引起化脓性疾病[1]，链球菌可引起脑膜炎等[2]。食源性致病菌主要包括大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli），溶血性链球菌（Hemolytic Streptococcus），福氏志贺氏菌（Shigella flexneri，S.flexneri）及沙门氏菌（Salmonella）等。

2 食源性致病菌检测技术

2.1 传统的检测技术

传统致病菌检测技术主要是以形态学特征、生化反应特征以及显微镜检测为主，一般方法是将待测样品直接染色镜检或通过分离培养获得单菌落后，再进行生化反应实验、血清学实验等对菌种进行鉴定[3]。这种方法不仅费时费力，而且对操作者的技术要求很高，需要不断进行分离培养，一般需要5～7 d，不能满足实际监督执法的时间需求。

2.2 仪器检测技术

由于致病菌的结构成分、代谢产物不同及微量生化反应不同，因此可以利用基质辅助激光解吸电离一飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、气相色谱-质谱（GC-MS）、全自动微生物鉴定仪等[4-5]对致病菌进行分类鉴定。其中蛋白质是鉴定致病菌种类的最主要指标之一，通过仪器分析致病菌的蛋白组分，获得不同的特征峰图谱，再与数据库进行比对，进而实现对致病菌的特异性检测。有研究者运用MALDITOF-MS方法与16SrDNA测序法对1019株菌株进行了鉴定实验对比，结果发现前者的准确性高达95%[6]。崔昌浩等人则通过GC-MS分析了微生物细胞内脂肪酸，建立了分析方法[7]。这些方法灵敏度高、高通量、特异性强、检测速度快，可鉴定多种成分，但仪器设备成本昂贵，无法普及使用。

2.3 免疫学检测技术

免疫学检测技术主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测，再利用同位素标记、酶联反应、化学发光物质等对检测信号进行放大，具有特异性强，灵敏度高等特点。常用的免疫技术具有特异性强、灵敏性高等优点，主要包括酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫荧光标记技术（IFT）、免疫胶体金标记技术（ICGT）、化学发光免疫分析（CLIA）、免疫层析技术（ICA）等。

2.3.1酶联免疫吸附

简称ELISA法，主要是将抗原-抗体的免疫反应与酶复合物结合，然后通过显色来检测。基本原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，然后与待测样品的抗原或抗体发生免疫反应，形成免疫复合物。免疫复合物所带的酶再与酶的底物进行催化反应形成有色产物。1977年，研究者首次运用ELISA检测食品中的沙门氏菌[8]，Hochel等研究人员又运用ELISA检测空肠弯曲菌[9]，检出限为50 cfu/mL。由于酶的催化效率很高，可以将反应效果放大，从而使该检测方法达到很高的敏感度。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。具有操作简单、成本低、无需任何昂贵仪器即可快速获得读数等优点，更适合现场测试。

2.3.2免疫荧光标记

免疫荧光标记是运用免疫学方法与荧光标记技术，通过荧光显微镜来确定特异性蛋白抗原的结合部位，进而检测出致病菌。此方法不仅检验速度快，而且敏感度与特异度均较高，现已成功应用于细菌、真菌以及病毒等微生物的快速检验中，并取得了满意效果[10-11]。但由于标记过程中会出现非特异性染色而造成假阳性结果，主观性判断易使结果存在一定偏差。

2.3.3免疫胶体金标记

免疫胶体金标记技术，简称ICGT，也是运用抗原-抗体特异性免疫反应原理，但是以胶体金作为标记物，是近些年研发的一种新型免疫标记技术[12]。Faulk等运用免疫胶体金标记法来研究沙门氏菌，这也是此技术首次在致病菌检测的应用[13]。有研究人员研发出一种可同时检测志贺氏菌和大肠杆菌O157：H7的免疫胶体金标记层析试纸条。免疫胶体金标记技术具有成本低、简单培训即可操作、无需复杂的大型仪器设备、简单且快速适用现场和基层检测使用（反应不超过15 min，具有灵敏度高）等特点。但是实际生产的胶体金由于批间差异大，抗原或抗体易从金颗粒表面脱离，使得标记物不稳定，并且只能获得定性或者半定量结果。

2.3.4化学发光免疫分析法

CLIA是将特异性免疫反应与高灵敏度的化学发光技术相结合，根据化学发光标记物与发光强度的关系以及标准曲线，计算出被测物的含量。有研究者运用多重夹心化学发光酶免疫检测法，同时检测鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7和肠炎耶尔森菌[14]。但在实际操作中，化学发光的强度与所处的实验环境因素有关，对发光强度-时间的曲线影响较大。

2.3.5免疫层析技术

免疫层析技术主要是将待测物与抗原或抗体标记形成的复合物与被富集或固定在层析条上的特定区域的抗体或抗原结合，再通过免疫技术显色，实现定性或定量检测。具有简便、快速、无需任何仪器设备等优势。Serebrennikova K.等研究发现，采用分级纳米金标记可提高侧流免疫层析的灵敏性，这种方法不需要增加新的制备步骤或消耗特殊的试剂（如抗体等），为提高基于纳米金侧流免疫分析的灵敏性提供了新的思路[15]。免疫学检测技术是基于抗原一抗体的特异性免疫反应而发展的，具有灵敏性高、特异性强等优势，但也存在一定的局限性，如抗体制备周期长、成本高、稳定性较差等，免疫反应过程易受目标物及竞争物质的干扰，出现假阳性。

2.4 分子生物学检测技术

分子生物学检测技术主要是通过检测致病菌中的特征性核酸序列实现对致病菌的鉴定，是一种体外核酸特异性扩增技术。主要方法有聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR（RT-PCR）、多重PCR、环介导等温扩增技术（LAMP）、基因芯片、DNA测序等。

2.4.1聚合酶链式反应

聚合酶链式反应简称PCR，是检测食源性致病菌最常用的分子生物学手段之一，可在体外快速扩增核酸序列，主要用于检测食品中单一的致病菌，如单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7、沙门氏菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌等[16]。该方法通过检测待测菌株是否含有毒力基因来鉴别区分产毒菌株和非产毒菌株，但对操作者的专业技能要求较高，不适用于现场检测[17]。

2.4.2实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR简称RT-PCR，是在PCR反应过程中加入特异性荧光探针，通过检测荧光信号的强度实现定量分析。Alejandro等建立了RT-PCR检测副溶血性弧菌tdh基因的方法，检出限为6 cfu/25g[18]。相比于普通的PCR，RT-PCR省去了电泳染色验证扩增结果，减少了外源核酸对结果的干扰，并且能持续检测PCR反应过程，实用性较高。

2.4.3环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术简称LAMP，是一种新型核酸扩增方法，由日本学者Notom于2000年首次提出。该方法主要是针对靶基因的6个区域，设计4种特异引物，在酶的作用下实现60℃～65℃恒温扩增。Maruyama等首先将LAMP用于检测大肠杆菌O157：H7的stxA2基因[19]，鉴于LAMP的快速性和敏感性等特征，此后，该技术被广泛应用于各种食源性致病菌检测中。与传统的PCR及RT-PCR相比，LAMP反应时间短、操作简单、无需特殊仪器，使用简便、快捷，适合快速检测。

2.4.4基因芯片

基因芯片是将大量的探针分子固定在芯片载体表面，然后与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号强度来获取样品分子数量级序列信息，是一种高通量、自动化、微型化的新型核酸测定方法。陈昱等利用基因芯片技术建立了检测3种食源性致病菌的方法，检出限为50 CFU/mL，该方法特异性好、灵敏度高[20]。基因芯片可一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足，是目前常用的致病菌检测方法之一。

分子生物学技术近年来在食源性致病菌检测方面发展较为迅速，主要优势体现在检测过程的快速性、高灵敏度、高特异性等方面。在实际应用中，也存在一定的局限性，如检测前的核酸提取、样品的增菌处理增加了检测的步骤，实验环境带入假阳性问题等，但随着研究的不断深入，这些限制性因素会被逐渐优化。

2.5 光谱分析技术光谱学主要研究

各种物质的光谱的产生及其同物质之间的相互作用，携带着一定的分子信息，可用于检测识别生物物质。光谱分析技术可克服实验环境的局限，不受外部环境干扰，减少致病菌培养环节，提高检测效率，实现在线监测实验数据[21-22]。光谱分析技术在食源性致病菌检测中的应用主要包括红外光谱技术、近红外光谱技术、表面增强拉曼光谱技术、荧光光谱技术、动态光散射技术、表面等离子共振光散射技术等。

2.5.1红外光谱技术

红外光谱技术一般用于研究物质分子，是一种振动光谱[23]。根据光谱的峰位、峰形等可鉴别不同的菌体。Wang等通过采集6种食源性致病菌的光谱，在3个不同的波段对致病菌成功进行鉴别[24]。这种方法只需少许的细菌悬浮液就能对致病菌进行种和亚种的区分，具有简便、快速、结果可靠的优势。

2.5.2近红外光谱技术

近红外（NIR）技术主要通过含氢基团H-X伸缩振动的倍频和合频吸收红外光，从而获得待测样品的信息。微生物主要由核酸、蛋白质等大分子物质构成，不同物质对近红外光的吸收不同，形成不同特性的光谱[25]。2003年，Janie Dubois等人利用微生物在1 000～2 350 nm波段的近红外光吸收特性，对微生物进行了分类学鉴定[26]。刘建学等利用立叶变换近红外光谱技术（FT-NIR）建立了大肠埃希氏菌O157：H7、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌的检测方法[27]。近红外技术具有快速、方便、能够同时实现多组分无损检测等优点，适用性强、具有广阔的应用前景。随着技术的不断成熟，近红外技术将成为一种更加高效的现代检测技术。

2.5.3表面增强拉曼光谱技术

表面增强拉曼光谱技术简称SERS，由Fleischmann于1974年首次提出[28]，和红外光谱一样同属分子振动光谱，能反映分子的特征结构。但是拉曼的信号比较微弱，需要将待测样品吸附在粗糙的金属表面，信号将会大幅增强，这就是表面增强拉曼散射现象。Gao等利用SERS建立了金黄色葡萄球菌的检测方法，检出限为1.5 CFU/mL[29]；Pearson等利用基于3-巯基苯磺酸（3-mbpa）作为纳米基底建立了具有选择性的单增李斯特菌检测方法，检出限为102CFU/mL[30]。SERS具有无标记识别、操作简单、可实现快速分析等优势，在快速检测食源性致病菌方面具有广阔的应用前景。

2.5.4荧光光谱技术

物质经过短波长的光照射后，辐射出较长波长的光，这种光就是荧光。荧光光谱技术是一种重要的光电检测技术。有研究表明，微生物体内的某些氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸）以及核黄素等可作为荧光物质[31]。Leblanc等采用荧光光谱技术对25种菌株进行了种、属水平的分类鉴定[32]；Sohn等利用荧光光谱技术建立了食品中大肠杆菌、沙门氏菌属、弯曲杆菌属方法[33]。荧光光谱技术具有灵敏度高、信号重现性好、测量精度高等优势，多用于定量分析，将逐渐成为现场检测的一种重要手段。

2.5.5表面等离子共振光散射技术

表面等离子共振光散射技术简称SPR，是一种物理光学现象，光学信号在传感器的作用下转换为电信号，从而实现对食源性致病菌的检测。1998年，Fratamico利用SPR传感器首次检测了大肠杆菌O157：H7[34]；Nguyen等采用SPR建立了沙门氏菌的检测方法，1 h内的检出限为107～109cfu/mL[35]。虽然在检测致病菌方面，表面等离子共振光散射技术灵敏度不够高，但作为一种便携型仪器设备在未来应用前景不可估量。

近些年，光谱技术的逐渐成熟，光其表现的无损检测、非侵入特点以及在食源性致病菌检测方面表现的优势，使得光谱技术在某些致病菌检测方面可以有效替代传统检测方法。