基于HPLC 指纹图谱鉴别四个不同品种的金银花叶

童凯，沈国强，黄月，李洁媛，曾繁富，闫蒙，甘婉莹，李东

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644000）

（2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川宜宾 644000）

金银花一般指忍冬科忍冬属植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.），是一种重要的药食两用物质，其花、茎、叶均具有较高的医疗和食用价值。在中医实践中，常用金银花的花蕾和藤茎治疗风热感冒、温病发热等症候，在食品行业中，常用金银花的花蕾或花朵生产植物饮料或代用茶[1]。金银花的叶因产量相对较高，富含绿原酸、黄酮等活性物质，且具有抑菌、抗氧化等药理作用，在许多功能性食品、中成药、动物饲料、化妆品、日化品中均具有广泛的应用[2,3]。

我国金银花及其近缘种的遗传资源十分丰富，有忍冬属植物98 种，5 亚种，18 变种[4]。现流通于市的常见近缘种主要包括灰毡毛忍冬L. macranthoidesHand.-Mazz.、红腺忍冬L. hypoglaucaMiq.、华南忍冬L. confuseDC.、黄褐毛忍冬L. fulvotomentosaHsu et S.C. Cheng，该4 种近缘种也可被统称为“山银花”[5]。此外，在长期的人工栽培历史中，逐渐形成了毛花系列、鸡爪花系列、野生系列等一系列金银花栽培品种。前人研究表明，不同种质来源的金银花，在农艺性状、营养风味、药理活性、经济价值等方面具有显著的差异，一旦误用或混用则可能导致严重的后果[6-9]。因此，准确鉴别金银花的种质来源，是金银花种植、加工、流通、消费等各环节，保障金银花产品品质和安全的重要内容。

现已开发的各类鉴别技术具有各自不同的适用条件，在实际工作中需要根据具体情况灵活使用[10,11]。例如，基于原植物形态特征的鉴别方法，具有简便易行的优点，尤其适用于野外鉴别，但对鉴别者的专业水平和经验依赖较强，而且对于局部样、破损样、粉末样等往往难于做出准确鉴定。基于植物DNA 序列特征的分子鉴别方法，具有专属性强的特点，尤其适用于精准鉴别，但因灵敏度过高，可能对极少量的、无意引入的异种DNA 污染造成误判[12]。近年来，基于样品内在化学物质群的组成和含量特征建立的化学指纹图谱技术，由于在准确度和灵敏度方面具有较好的平衡，已在咖啡[13]、陈皮[14]、橄榄油[15]等众多产品的质量评价和真伪鉴别中得到成功应用，表现出广阔的潜力。

本研究以4 种不同种质来源的金银花叶为研究材料，利用高效液相色谱仪（HPLC）建立化学指纹图谱，结合主成分分析、聚类分析等多变量统计分析方法，比较分析4 种金银花叶的化学物质群差异，以期为不同种质金银花的鉴别及其产品的质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物

供试金银花叶于2019 年11 月采集自四川省雅安市天全县，经植物学形态考察初步鉴定，来自于4 个不同的种质资源，分别为忍冬栽培品种“北花1 号”（Bei Hua 1,L.japonicaThunb.）、忍冬栽培品种“四季金银花”（Si Ji,L. japonicaThunb.）、红腺忍冬(L.hypoglaucaMiq.)和灰毡毛忍冬（L. macranthoidesHand.-Mazz.）。每个种质类型采集8 批次样品，依次编号为B1-B8，S1-S8，H1-H8 和Y1-Y8，每批次样品由相同种质的不同植株的叶片混合构成，合计采集32批样品。

图1 供试金银花原植物Fig.1 Honeysuckle plants from 4 different genetic varieties

1.1.2 主要设备

Agilent 1260 高效液相色谱仪，美国安捷伦科技公司；KQ-700DE 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；101-3B 电热恒温干燥箱，浙江力辰仪器科技有限公司；101-3AB 高速中药粉碎机，温州顶历医疗器械有限公司；UPT-1-100L 超纯水器，成都超纯科技有限公司。

1.1.3 主要试剂

色谱级乙腈、甲醇、甲酸，购自于赛默飞世尔科技（中国）有限公司；无水乙醇，购自于成都科隆化学品有限公司；超纯水由超纯水仪提供；绿原酸标准品（纯度＞98%），购自于成都德思特生物技术有限公司，生产批号为DST190906-021。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理

选择各批次样品中无病斑和虫眼的新鲜健康叶片，除去泥尘、杂质，在105 ℃下杀青5 min 后，于60 ℃恒温干燥约4 h，粉碎过60 目筛，低温避光保存备用。

1.2.2 溶液制备

精密称量0.5 g 样品粉末，加入20 mL 50%乙醇溶液，称定重量。40 kHz 下超声提取30 min，期间震荡两次。静置冷却到室温后再次称重，用50%乙醇溶液弥补损失的重量。静置30 min 后，取上清液1 mL，过0.45 μm 微孔滤膜，取滤液低温保存备用。另精密称取适量标准品，用50%甲醇（色谱级）溶解后，低温保存备用。

1.2.3 色谱条件

在陈魁霞等[16]研究的基础上略作修改，采用如下色谱条件：色谱柱：Infinity Lab Poroshell 120 EC C18柱（150 mm×4.6 mm）；流动相（A：0.1%甲酸，B：甲醇，C：乙腈）；流速：0.5 mL/min；检测柱温：30 ℃；检测时间：40 min；检测波长：327 nm；梯度洗脱程序：0～36 min，流动相A：90%～67%，流动相B：0%～3%，流动相C：10%～30%；36～40 min，流动相A：67%～10%，流动相B：3%～10%，流动相C：30%～80%。

1.2.4 数据分析

采用Open LAB Chemstation 化学工作站提取色谱数据，采用Microsoft Excel 进行数据预处理，采用MetaboAnalyst 4.0 软件进行聚类分析和主成分分析。

2 结果与讨论

2.1 指纹图谱的建立

2.1.1 色谱检测与数据提取

图2 不同种质金银花叶典型指纹图谱Fig.2 Typical HPLC fingerprint of different honeysuckle leaves

32 批次样品溶液按1.2.3 所述色谱条件连续进样测定，得到相应的HPLC 色谱图。4 种不同种质来源的金银花叶典型HPLC 色谱图见图2。各个色谱图可在0～40 min 内基本出峰完毕，且出峰数量丰富，峰形良好，从中提取出特征色谱峰34 个，按照保留时间先后顺序，依次编号1～34。同时记录各色谱峰的峰面积数据，组成32×34 的分析数据集。

2.1.2 色谱峰指认

根据《中国药典》（2015 版），金银花以绿原酸和木犀草苷作为其质量评价的指标成分。因此，在相同色谱条件下，分别进样测定绿原酸和木犀草苷标准品溶液，记录其保留时间并与样品溶液色谱图比对。结果显示，本实验色谱图中第7 号色谱峰为绿原酸的物质信号（图3），而木犀草苷在该色谱条件下未被检出。

图3 色谱峰指认结果Fig.3 Result of chromatographic peak identification

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验

以绿原酸标准品作为内标溶液，连续进样6 次，记录并计算其色谱峰面积相对标准偏差RSD 值，为3.02%，变异幅度较小，说明所建立的色谱方法精密度较好。

2.2.2 稳定性试验

制备混合叶片样品，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h 后进行测定，记录并计算绿原酸色谱峰面积相对标准偏差RSD 值，为4.78%，变异幅度较小，说明所建立的色谱方法稳定性较好。

2.2.3 重现性试验

平行制备5 份四季金银花样品溶液，依次进样测定，记录并计算7 号峰（绿原酸）的色谱峰面积相对标准偏差RSD 值，为1.55%，变异幅度较小，说明所建立的色谱方法重现性较好。

2.3 主成分分析

主成分分析（PCA）是一种降维技术，其基本思想是用少数几个具有代表性的综合指标（主成分）代替多个原始变量，从而实现降维观察数据特征的多元统计分析方法[17,18]。例如，宋九华[19]等人针对不同产地金银花样品构建了HPLC 指纹图谱，然后利用主成分分析方法，对图谱中13 个共有峰面积所构成的数据集进行降维比较后发现，产自于四川、山东、贵州、安徽、河南等不同产地的16 批次金银花可以分为3个大产区，为金银花的产地识别和质量控制提供了有益的方法参考。

本研究以32 个不同品种来源的金银花叶为对象构建HPLC 指纹图谱，对从中提取的34 个色谱峰的峰面积组成的数据矩阵进行主成分分析。结果显示，前两个主成分（PC1 和PC2）分别表征了原始变量35.1%和16.2%的变异信息。在以PC1 和PC2 为横纵坐标绘制的二维得分图中，32 个供试样品的分布呈现4 种明显不同的聚集趋势，来自于相同品种的样本倾向于聚集为相同一组，而不同品种的样品则相互远离。尤其，在PC1 方向上，8 个灰毡毛忍冬样品（Y1-Y8）与其他3 种样品均相距较远。以上结果说明，4 种不同品种来源的金银花叶的总体化学物质群具有显著差异，通过主成分分析可以对不同品种来源的金银花叶取得较好的区分效果，这为实际应用中区别使用不同品种的金银花原料，以及相关产品的质量控制提供了参考依据。类似的，Qingxia Wang[20]等人从植物学形态、ITS 序列、花蕾中活性成分积累等方面，详细比较了忍冬、灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬、红腺忍冬等4种不同品种的金银花的差异，结果发现正品金银花（L.japonicaThunb.）与其他3 种易混淆金银花品种均具有较大差异，这与本研究的结果是一致的。

图4 主成分分析得分图Fig.4 Score plot of PCA

图5 聚类分析结果Fig.5 Result of cluster analysis

2.4 聚类分析

系统聚类法的基本思想是将多个样品各自作为一类，然后计算各类之间距离的远近，首先将距离最近的两类合并成新的一类，然后用所得到的新的一类和其他类的样品再进行距离分析，将此时距离最近的再归为一类，直至将所有样品合为一大类，最终形成聚类树状图[21,22]。邵林[23]等人利用聚类分析的方法，对山东地区10 个不同栽培品种金银花花蕾的HPLC 指纹图谱进行分析，发现金银花花蕾的化学物质群特征，不仅在植物物种之间，也包括在不同栽培品种之间仍然具有较大差异。本研究利用系统聚类的方法，以欧氏距离为度量，对32 个样品进行聚类分析。结果显示，32 个样品中所有供试的灰毡毛忍冬样本首先被单独聚为一类（图5，组1），提示其化学物质群特征最大程度区别于其他3 个品种的样品（图5，组2），这与上述主成分分析的结果是一致的。继续聚类分析显示，8 个红腺忍冬的样本可再继续被单独聚为一类（图5，组2-1），以区别于“北花1 号”和四季金银花的样本（图5，组2-2）。值得注意的是，“北花1 号”和四季金银花虽同为忍冬植物的不同栽培品种，但仍然具有相对稳定和特殊的内在化学物质群，在聚类分析时还可继续被各自聚为一类（图5，组2-2a 和组2-2b），这与上述邵林[23]等人的研究结果是类似的。在本研究中，相较于四季金银花，其他品种中与之具有相似化学特征的金银花品种依次为“北花1 号”，红腺忍冬和灰毡毛忍冬。这提示金银花叶的化学物质群差异，反映了各品种之间的亲缘关系强弱，并可据此建立HPLC 指纹图谱用以辅助不同品种的鉴别分析。

进一步地，对各色谱峰面积在各种质之间的差异进行方差分析，根据P 值大小取前10 个最显著差异的色谱峰，并按峰面积相对大小值绘制热力图（图5）。结果显示，指纹图谱中第16 号、24 号、18 号、14 号、6 号、29 号、8 号、5 号、7 号、11 号色谱峰是各种质金银花叶化学差异的最主要来源。其中，7 号峰经指认为绿原酸，其相对含量按高低依次为灰毡毛忍冬、红腺忍冬、北花1 号和四季金银花。这与肖作为[24]等人关于金银花和山银花中绿原酸含量的定量测定结果是吻合的。其他具有显著差异的色谱峰，经质谱检测等方法进一步鉴定后，可开发作为稳定的化学标记，用以辅助金银花不同种质之间的鉴别分析。朱姮[25]等人利用RRLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS 技术建立了山东金银花花蕾的多指标定量指纹图谱，从中准确鉴定了32 种化学成分，并且实现了不同品种金银花和湖南山银花的正确区分。而关于金银花叶片的化学成分构成，前人的相关研究表明，绿原酸、木犀草苷、芦丁等酚酸类、环烯醚萜苷类、黄酮类物质是金银花叶发挥抑菌、抗病毒、抗氧化、抗血小板聚集等药理活性的主要物质基础[26]。陈魁霞[16]等人建立了金银花中10 种酚酸类成分的HPLC 同时测定方法，赵金娟[27]等人测定了不同品种金银花的花和叶中活性成分含量，发现金银花的叶中木犀草苷含量高于花，且不同品种之间存在显著差异。这些研究为金银花叶的化学鉴别和开发利用研究提供了良好的方法和思路参考。

3 结论

本研究所建立的HPLC 指纹图谱，揭示了灰毡毛忍冬、红腺忍冬、“北花1 号”、四季金银花4 种不同种质的金银花叶具有显著不同的化学物质群特征。指纹图谱中第5、6、7（绿原酸）、8、11、14、16、18、24、29 号色谱峰是各个种质金银花叶化学差异的主要来源，结合主成分分析和聚类分析，可实现对金银花不同种质之间的鉴别分析。