病原微生物耐药性新型检测技术的研究进展

曹 阳， 陈 薇

病原微生物对抗菌药物耐药性的日趋增高是对全球人类健康的主要威胁，而对其快速检测、定量分析及结合抗菌药物管理，是控制耐药性出现和传播的关键干预措施。但目前临床微生物工作中使用更多的还是表型抗菌药物敏感性检测（antibiotic susceptibility testing，AST），多为肉汤微量稀释法、纸片法等。这些方法需要较长的孵育时间，不能及时指导抗感染治疗。近年来开发了一些新型的技术应用于耐药菌检测，现将相关的新兴检测技术综述如下。

1 分子生物学技术在耐药性检测中的应用

1.1 耐药基因核酸检测

现有多种新型耐药性检测的分子生物学方法，如核酸探针微阵列[1]，等温核酸扩增技术[2]，PCR扩增产物高分辨率熔解曲线分析，以及将菌种鉴定、熔解曲线和机器学习（machine learning technique）相结合的方法[3]。基于核酸扩增技术的耐药基因检测方法可以缩短报告时间，早期进行抗菌药物调整进行靶向治疗。有许多商品化仪器如全自动检测分析系统GeneXpert利用PCR技术可检测mecA和/或mecC基因，该系统还可以检测万古霉素耐药基因vanA和vanB以及针对直肠拭子中碳青霉烯类耐药基因KPC、NDM、VIM、OXA48 和IMP的筛查[4-6]，GeneXpert系统高度整合样品制备、扩增及检测于一个独立的试剂盒中，并将其自动化，只需很少的人工操作，但受荧光通道限制，通常只能同时报告2～6种靶标。近年来，数种新的多重扩增检测系统可以同时进行菌种的鉴定和耐药基因的检测。BioFire公司的 FilmArray BCID 检测系统采用巢式多重PCR的原理，将核酸提取、PCR扩增和产物检测集成到一个封闭的测试条中，可检出来自血培养中24种常见的菌血症病原菌和3种耐药基因mecA、vanA/B和KPC，该系统根据不同测试条组合，最多可同时报告43种病原体/耐药基因结果。Curetis Unyvero系统采用多重PCR技术用于肺炎、植入物和组织感染、血流感染和腹腔内感染的诊断，包含更为全面的病原体和耐药基因检测模块[7-8]。Nanosphere VERIGENE系统利用金纳米颗粒探针技术，应用在阵列和扩增两种方法中，相对荧光基团灵敏度更高，目前检测试剂盒涵盖了血流感染、胃肠道感染和呼吸道感染，2 h内提供检测结果。针对血培养阳性的标本，具有两种卡盒分别检测革兰阳性菌和革兰阴性菌，该系统也包括一些耐药基因（mecA、vanA、vanB、CTX-M、KPC、IMP、NDM、OXA和VIM）的检测[9]。耐药性的分子检测方法具有快速与覆盖范围广的特点，其临床使用变得越来越广泛。

1.2 耐药性蛋白质标志物检测

并非所有检测耐药性的分子生物学方法都是基于核酸。现已报道了多种直接检测耐药性蛋白质标志物（例如β内酰胺酶）的方法，如特定蛋白芯片[10]。这些方法通常使用抗体来捕获和富集蛋白质，可用荧光标记抗体或蛋白质便于观察，但抗体与耐药性蛋白之间的相互作用需要优化。目前已经开发了多种侧向层析检测（LFA）产品用以检测β内酰胺酶。其中一项针对新德里金属β内酰胺酶NDM-1的LFA检测，共收集了来源于缅甸的350株细菌，结果显示具有100%的灵敏度和特异度[11]。在其他类似的研究中，有联合检测OXA48、IMP、NDM和VIM酶的LFA，还有针对mcr-1酶的LFA，研究结果都非常理想[12-13]。虽然目前已经开发出多种可有效检测和鉴定耐药性相关大分子的方法，但检测的靶目标过于单一，无法掌握细菌的全部耐药信息。

1.3 全基因组学耐药性检测

目前在分子诊断领域，出现了一种倾向使用基因组学方法来鉴定细菌种类和抗菌药物耐药性的趋势。随着测序技术的进步，应用全基因组测序，再加上生物信息学工具快速收集和分析这些测序得到的数据，基本上可以追踪导致细菌耐药的所有基因。但值得注意的是将生物信息学数据与不同的数据库结合使用可能导致不同的检测结果[14]。目前基因组学检测常规应用的最大障碍是缺少成本低廉的测序平台以及对用户“加入样本，输出结果”的生物信息解决方案。近来，引起广泛关注的纳米孔测序技术，该技术相对易于使用，并且生物信息学的界面已取得实质性进展[15]，该技术产生的序列很长，可以更容易组装成完整的基因组，并且能够鉴定质粒和大规模的基因组重排，但在准确性上仍落后于其他测序技术，而新的算法（例如机器学习）可以纠正这些缺陷。全基因组测序大大提高了基因型与表型之间的符合性，但这需要不断地通过表型和基因型方法筛选新的耐药性机制和标志物、成熟的数据库以及开发可视化智能软件等才能逐步实现。

2 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）检测

近年来，虽然临床微生物的鉴定越来越多通过MALDI-TOF MS来完成，但是耐药性检测仍很大程度上依赖于传统或分子生物学技术。目前已有许多研究者在使用MALDI-TOF MS或其他质谱技术进行耐药性检测的研究，其中一些研究尚处于原理证明阶段，但另一些已经完成了商业化。

2.1 检测细菌的耐药性标志物

通过质谱进行耐药性检测最直接的方法是检测细菌内的耐药蛋白（如β内酰胺酶)与发生改变或被修饰的细胞组分，根据耐药菌与敏感菌的质谱峰图存在的单个峰值或峰簇差异进行区分。β内酰胺酶有多种类型，序列变异性高、分子量范围从25～40 kDa，使用MALDI-TOF MS可以检测到质量超过数百kDa的蛋白质，但通常仅在纯化和浓缩步骤之后才能检测到。Chang等[16]使用爆轰纳米金刚石处理样本后，能够检测到鲍曼不动杆菌分离株中的碳青霉烯酶特征峰（m/z 40 279±87），但15株敏感菌中有4株在此质量范围内也显示信号。Espinosa等[17]使用芥子酸为基质的双层样本制备技术处理大肠埃希菌，经质谱分析发现在所有产CMY-2型AmpC酶的菌株中都存在（m/z 39 800）峰，而对照组中没有发现，灵敏度和特异度都达到了100%。这种方法还可用于检测阳性血培养物中的KPC-2型碳青霉烯酶（m/z 28 544）。

黏菌素的耐药机制多与脂多糖修饰有关，而脂质A是脂多糖结构的重要组成部分，当通过至少一个磷酸基团的取代修饰脂质A时，黏菌素与脂多糖的相互作用会降低[18]。质粒编码的磷酸乙醇胺转移酶可导致脂质A的修饰，耐黏菌素大肠埃希菌与质谱中野生型脂质A的峰相比，脂质A分子中的这些修饰可以对应其1 796 m/z 相对分子质量+123处的峰[19]。在肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌中也可以检测出类似的质谱峰漂移[20]。

2.2 监测抗菌药物的降解

将质谱作为追踪抗菌药物降解的工具，是分析临床分离菌株耐药性的另一种策略。将疑似含有抗菌药物水解酶的细菌暴露于抗菌药液中，在适当的温度下孵育预设的时间，离心后收集样品，并将少量上清液转移至靶板上，使用MALDI-TOF MS分析并记录抗菌药物代谢的动力学。这种方法主要针对β内酰胺酶水解活性的检测，因其结果是基于β内酰胺类抗生素和β内酰胺酶水解产物的峰高比发生变化而获检测，故不适用于非产酶耐药机制的细菌[21]。MALDI-TOF MS并不是完全定量的方法,使用内标进行定量分析最多只能得到半定量结果。这意味着在估算代谢率时，将考虑峰高或峰面积之比，而不是真实的浓度值。因此，在未能得出明确的阳性信号之前，抗菌药物代谢反应都必须持续进行下去。这种检测与细菌的接种菌量有关，即如果细菌接种物浓度足够大，大多数碳青霉烯酶在不到一个小时内即能迅速获得检测结果。如Kawamoto等[22]选择美罗培南为底物，检测了145株肠杆菌科细菌的碳青霉烯酶，即对美罗培南的水解反应，结果显示所有携带IMP金属酶的菌株都被正确的识别为阳性，即使是有较低美罗培南MIC值（1 mg/L）的菌株；而所有不携带IMP金属酶的菌株即使美罗培南MIC值很高（4 或8 mg/L）也被识别为阴性。也有研究者利用MALDI-TOF MS直接在报警的阳性血培养中快速检测产碳青霉烯酶的细菌，结果都令人满意[23]。对于水解活性低的OXA酶，孵育时间和催化物的添加也有至关重要的作用，Rapp等[24]发现将含有OXA酶的不动杆菌孵育时间延长到12 h，可以得到100% OXA酶检测阳性的灵敏度，而Papagiannitsis等[25]指出添加碳酸氢铵可以提高OXA-48酶的反应活性，有助于质谱的检测。

2.3 抗菌药物作用下微生物的生长检测

该项技术可能是最接近常规抗菌药物敏感性检测的技术，并且可以提供分离菌株药敏结果而不是其耐药性信息。目前已经提出了几种方案，其中已商业化的MBT-ASTRA 似乎是最有希望的一种。该方案将菌株在有或无抗菌药物的条件下孵育，裂解细胞时加入稳定的蛋白质作为内标，便于测量多肽和小蛋白的数量，这些数量与菌株的数量有关，因此也与菌株的生长有关。通过对质谱峰的定量分析，依据整体质谱峰曲线下面积，计算相对生长比值以检测细菌是否耐药。Lange等[26]对108株克雷伯菌属分离株的研究发现，在美罗培南浓度为8 mg/L的培养基中孵育1 h后，利用MBT-ASTRA方案检测，与E试验结果相比灵敏度为97.3%，特异度为93.5%，该方法也适用其他多种细菌与抗菌药物的组合。近期又提出一种新的方法，为直接靶向微滴生长试验（microdroplet assay）[27]，该方法是将数微升细菌悬液微滴直接加到有或无美罗培南的靶孔上孵育3 h后，将培养基与细菌分离，进行MALDI-TOF MS检测，结果通过软件分析。如无抗菌药物添加的生长对照细菌鉴定评分≥1.7，则判定实验结果为有效，因此有抗菌药物的细菌鉴定评分≥1.7 判定为耐药，＜1.7为敏感。这样可以进行多个抗菌药物浓度的测试，从而更接近CLSI或EUCAST指南中标准，而不是仅测试单一浓度。最近，Correa-Martinez等[28]对微滴生长试验进一步改进，它具有完整的抗菌药物浓度（0.25～512 mg/L）并加入了β内酰胺酶抑制剂（棒酸）。对于微滴生长试验，手动去除液体培养基和接种密度等可能造成的不确定性也要予以关注。

3 新型工程技术在耐药性检测中的应用

3.1 基于磁珠的耐药性检测

密歇根大学的研究人员开发了异步磁珠旋转（asynchronous magnetic bead rotation，AMBR）传感器，以测量单个细菌细胞的生长和药物敏感性[29]。其原理是将磁珠放入细菌悬浮液中，并置于外部旋转磁场内以控制磁珠的旋转。随着时间的流逝，细菌会附着在珠子上，形成珠-细菌复合物。由于细胞分裂引起细胞长度发生变化，而旋转动力学也发生变化。加入抗菌药物后，受影响的生长动力学曲线在旋转动力学中产生独特的可检测特征，通过测量这些扭矩变化，可检测到细菌长度的变化。后期他们使用了自组装的簇状磁性微粒来检测链霉素和庆大霉素对大肠埃希菌的MIC，该方法在短时间内（1.5 h）可以清楚地测量出细菌生长的微小变化。但是，此过程需要特定的悬浮培养物，并且对于较高浓度的细菌无效。

3.2 纳米机械传感器

纳米机械传感器是一种超灵敏振荡器，用于测量由特定目标物质吸附或选择性结合到所研究的基质或样品上而引起的质量变化。其中原子力显微镜（atomic force microscopy）是应用最广泛的纳米机械传感器。不同浓度的抗生素，可以对菌体细胞产生不同的影响，从表面出现小孔到细胞壁完全溶解。有研究者已使用原子力显微镜成功测量了抗生素作用下敏感细胞的形态变化，但该方法不提供实时AST结果。Longo等[30]已经开发了一种带有原子力显微镜尖端的微悬臂梁来研究细胞的微运动，将细菌附着到悬臂的表面，并测量其动态波动，通过测量波动幅度，研究在抗生素作用下大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的纳米尺度运动及其代谢活性从而获得MIC/MBC结果。

3.3 微流体技术

微流体技术可以将多种功能（细菌培养、核酸杂交与扩增及细胞裂解等）合并到1个芯片上，也称为“芯片实验室”，通过各种方式监测微流体中生物样本的物理或化学行为变化。2014年，Weibull等[31]开发了具备纳升孔的微流体设备，使用光密度测量，实时观察纳升孔中大肠埃希菌在环丙沙星、头孢噻肟和氨苄西林作用下的生长情况，并采用一种新的数学算法计算细菌生长的迟缓期，从而可在4 h内获得MIC。为了减少AST时间，Kaushik等[32]开发了基于微滴微流体技术的荧光设备，该设备具有内置的孵育区，可在1 h内提供抗菌药物有效性检测结果，是目前最快的表型抗菌药物有效性检测设备之一。在微流体技术的基础上，又开发了多种新的技术，如梯度微流体、微流体pH传感器、应激诱导微流体等，都在快速检测细菌耐药性上做出了大量的尝试。

除了以上介绍的新型耐药性检测技术外，还有拉曼光谱法、流式细胞术、表面等离子体共振、阻抗谱技术等多种新方法。相信在未来，新兴的技术会更加成熟和完善，为患者感染性疾病的快速诊疗带来希望。