调节性T细胞在结直肠癌发生发展中的作用及相关治疗*

刘莹 孙燕

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率在2018年全球新增癌症病例中居第4 位，死亡率居第2位[1]。CRC 在中国女性和男性肿瘤患者中的发病率分别居第4 位和第5 位，死亡率均居第5 位[2]。目前，CRC 的治疗手段仍以手术和放化疗为主，近年来靶向治疗和免疫治疗也在CRC 中不断开展。研究报道错配修复缺陷（mismatch repair deficiency，dMMR）/微卫星高度不稳定型（microsatellite instability-high，MSI-H）的CRC 患者常伴有大量的免疫细胞浸润，更可能受益于免疫治疗[3]。一些学者积极探索肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中发生的免疫反应对CRC 发生发展的影响以及如何通过免疫治疗改善CRC 患者的预后，其中就包括调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）的作用和/或治疗价值[4]。Treg 在宫颈癌、乳腺癌、黑色素瘤等肿瘤中与不良预后有关[4]，但在CRC 中的作用和对预后的影响尚存在争议。本文就Treg 在CRC 发生发展中的作用及其作为潜在治疗靶点时可能采取的治疗策略进行综述。

1 Treg 的来源及功能

Treg 是一类对控制自身耐受和炎症反应至关重要的T 细胞亚群，分为CD4+Treg 和CD8+Treg 两种类型[5]。CD4+Treg 已被广泛研究，但CD8+Treg 因缺乏特异性标记而导致相关研究较为局限。两者在功能上存在部分差异，一个非常明显的区别是CD8+和CD4+Treg 分别识别主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ或MHC-Ⅱ呈递的同源抗原，由于MHC-Ⅰ几乎存在于所有的有核细胞，CD8+Treg 可以被几乎所有细胞激活抑制活性，CD4+Treg 仅激活于表达MHC-Ⅱ的细胞[5]。本文主要对CD4+Treg 的来源、相关功能和治疗进行阐述。

最初，Treg 被定义为表达CD4 和CD25 的抑制性细胞，随后研究发现叉头框蛋白P3（forkhead box P3，FoxP3）是Treg 发挥抑制作用的主要调节因子[6]。而FoxP3 在CD4+Treg 中表达水平是不同的，低表达FoxP3 的CD45RA+CD25lowTreg 被认为处于静息状态，免疫抑制能力较弱，在TCR 的刺激下可以分化为高表达FoxP3 的活化型Treg[6]。Treg 存在两条发育途径[7]，胸腺来源的Treg（thymic Treg，tTreg）依赖于与自身肽或MHC-Ⅱ的高亲和力相互作用，外周来源的Treg（peripheral Treg，pTreg）则需要依靠转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）激活幼稚T 细胞，白介素（interleukin，IL）-4 和IL-6 缺乏也可以导致pTreg 的发育。

Treg 表面表达多种黏附因子和趋化因子受体，因此Treg 并不具备一致的表型，这些受体可以针对次级淋巴组织、非淋巴组织及炎症部位[7]。在次级淋巴组织中，Treg（主要是静息状态的Treg）可以通过抑制抗原提呈细胞的功能抑制T 细胞的活化。非淋巴组织中广泛存在被活化的Treg，通过表达不同的黏附因子和趋化因子受体，调节多种效应细胞靶点的活性，抑制炎症反应，防止组织损伤和自身免疫，维持非淋巴组织的耐受性[6-7]。

2 结直肠癌中Treg 的产生途径及作用

2.1 肿瘤局部浸润的Treg 的产生途径

与正常Treg 产生过程不同，TME 中多重因素可共同影响Treg 生成。其中趋化因子可以从胸腺、骨髓、淋巴结和外周血招募Treg 到肿瘤局部并刺激Treg 增殖，功能失调的抗原提呈细胞也可以诱导Treg 分化和增殖；此外，TME 中的抑制性分子能直接将CD4+CD25+T 细胞转化为CD4+CD25+FoxP3+的Treg[6]。与健康人相比，CRC 患者外周血中Treg 百分比增加，并且Treg 的浸润水平在CRC 组织中高于正常组织和周围组织，离肿瘤最近的区域淋巴结高于远处淋巴结和非区域淋巴结[8-9]。

2.2 Treg 在CRC 中的作用

Treg 不仅通过表达CD39、上调细胞毒性T 淋巴细胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）和程序性死亡受体-1（programmed death -1，PD-1）等的表达获得更强的免疫抑制功能[10-11]，还可以通过分泌IL-10 和IL-35 协同调节CD4+和CD8+TIL 中的BLIMP1 抑制性受体轴，阻碍有效的抗肿瘤免疫[12]，并且以减少内皮细胞CXC 趋化因子配体10 产生[13]的方式抑制T 细胞迁移到肠道肿瘤。除此之外，Treg 不仅对肿瘤特异性抗原具有特异性反应[14]，还可以通过调节IL-6 表达调控CRC 细胞生长[15]，并通过抑制Th1 的生物学活性进而抑制Th1 分泌血管生成抑制因子（TGF-β 等），以及产生血管生成因子神经菌毛素-1（neuropilin-1，NRP-1）等间接或直接促进CRC 血管生成[16-17]。

尽管Treg 的免疫抑制作用有利于肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫，有研究认为至少在炎症相关性肿瘤发生的早期，Treg 可能通过抑制炎症反应阻碍肿瘤的发生发展[18]。并且Treg 对CRC 预后的影响也存在争议，部分研究认为Treg 与预后良好有关[19]，另一些认为Treg 与不良预后有关[20-21]，Saito 等[20]报道这种差异可能是因为FoxP3+T 细胞存在不同亚群，即eTreg 和non-Treg，两者难以通过免疫组织化学标记区分。与以non-Treg 浸润为主的CRC 相比，具有大量eTreg浸润的CRC 患者预后更差。

2.3 肿瘤微环境对Treg 的影响

肿瘤细胞及其所处的TME 对Treg 同样具有调控作用。除分泌趋化因子招募Treg 到肿瘤部位外[22]，CRC 细胞中的局灶性黏附激酶也可以通过调节趋化因子和细胞因子的转录和表达，驱动并调控Treg 的募集和浸润水平[23]。另外，肠道微生物也可能通过促进Treg 的积累参与免疫抑制[24]。

3 Treg 作为治疗结直肠癌的潜在靶点

Treg 介导的外周免疫耐受是免疫治疗过程中要克服的难题，因此在治疗时为了消除Treg 的免疫抑制活性，往往考虑剔除或抑制Treg，增加效应T 细胞的活性和积累，从而达到免疫治疗的目的。有研究报道，自20 世纪开始就有学者试图通过耗竭Treg 进行治疗，如使用低剂量的环磷酰胺、靶向特定表面标记（CD25）等[6]。免疫检查点作为近年来免疫治疗的热门领域被广泛研究，在包括转移性MSI-H/dMMR 型CRC 在内的多种癌症中显示出良好的效果[3]，并且已经证实Treg 可以表达包括CTLA-4、PD-1 及其配体（programmed death-ligand 1，PD-L1）等在内的多种表面标记[25]，进一步提示靶向Treg 在免疫治疗中的重要性。此外，联合治疗、针对Treg 表面受体（如糖蛋白A 重复序列等）等的治疗策略也已展开研究[26-27]。

3.1 免疫检查点抑制剂

目前临床常用的免疫检查点是CTLA-4 和PD-1/PD-L1，而MSI-H/dMMR 已被确定为对免疫检查点抑制剂反应的标志物。

3.1.1 CTLA-4 抑制剂 如前所述，CTLA-4 在活化的T 细胞表面表达，表达上调后可以通过与CD28 竞争CD80/CD86 从而中断TCR 信号传递，抑制T 细胞活化进而维持肿瘤细胞的存活[11]。抗CTLA-4 的主要机制是通过抗体依赖的细胞毒性作用介导Treg 耗竭，阻断CTLA-4 与CD80/CD86 的相互作用，促进T 细胞增殖而激活抗肿瘤免疫[11]。CTLA-4 抑制剂包括ipilimumab（已上市）和temelimumab，主要用于治疗转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌和膀胱癌[25]，在CRC 中主要集中于与PD-1/PD-L1 抑制剂联合使用。

3.1.2 阻断PD-1/PD-L1 PD-1 也称CD279，是免疫球蛋白超家族，有两个主要的配体PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC）。PD-1 与PD-L1 结合可以使T 细胞增殖受抑制，最终导致T 细胞耗竭[6]。PD-1/PD-L1 抑制剂主要包括pembrolizumab（已上市）、nivolumab（已上市）和durvalumab、atezolizumab（已上市）、avelumab，可以恢复效应T 细胞的功能，增加CD8+T/Treg 比率来负调节Treg 的数量[25]。近年的临床研究表明，MSI-H/dMMR 的转移性CRC 更容易从PD-1抑制剂中获益，在微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）/错配修复完整（mismatch repair proficiency，pMMR）的CRC 几乎无应答[3]。Andre 等[28]评价了pembrolizumab 作为一线治疗方法与标准化疗在dMMR 的转移性CRC 中的疗效与安全性，结果显示pembrolizumab 作为一线治疗方法后中位无进展生存（progression-free survival，PFS）有所改善（16.5 个月vs.8.2 个月，HR=0.6，P=0.000 2），且出现3～5 级药物相关不良事件低于标准化疗（22%vs.66%）。

3.2 联合治疗策略的临床前或临床研究

3.2.1 CTLA-4 抑制剂联合PD-1/PD-L1 抑制剂治疗 目前，已在MSI-H/dMMR 的转移性CRC 中进行多项小剂量ipilimumab 联合nivolumab 使用的临床研究，客观反应率可达55%～69%，PFS 和总生存（overall suvival，OS）较单一PD-1 抑制有所提高（1年PFS 及OS 分别为71%vs.41%，85%vs.76%）[26,29]。小剂量ipilimumab 联合nivolumab 的治疗策略展示了强大而持久的临床效益，或许为MSI-H/dMMR 的转移性CRC 患者提供了新的一线治疗方案。

3.2.2 PD-1 抑制剂联合血管内皮细胞生长因子受体抑制剂治疗血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体VEGFR 的激活与免疫抑制微环境有关，通过增加抑制性免疫检查点表达和募集免疫抑制细胞（包括Treg 和髓源性抑制细胞），在肿瘤免疫逃避中发挥作用[30]。最近一项VEGFR 抑制剂regorafenib 联合PD-1 抑制剂使用的回顾性研究纳入了23 例MSS/pMMR 型CRC 病例，结果显示治疗后无患者达到客观反应率，但疾病控制率为78.3%[31]。另一项纳入25 例CRC 和25 例胃癌的Ⅰ期临床试验显示nivolumab 联合regorafenib 使用后客观反应率为36%（包括7 例MSS CRC，1 例MSI-H CRC），中位PFS为6.3个月，1年PFS和1年OS为分别为41.8%和68%，治疗前后Treg 数量显著减少（NCT 04030260）。为了更好地评估该策略对MSS CRC 的疗效，有必要纳入更多病例进行进一步研究。

3.2.3 纳米载体联合吲哚胺2,3-双加氧酶1 抑制剂 为了实现高效的免疫治疗，Hu 等[32]设计了用于多种免疫调节剂的超分子前药物纳米载体。将光敏剂透明质酸、焦脱镁叶绿酸A 和吲哚胺2,3-双加氧酶1（indoleamine2,3-dioxygenase 1，IDO1）抑制剂NLG 919 整合到超分子纳米载体中，即光动力免疫治疗联合IDO1 阻断，可以导致Treg 数量减少并抑制CRC小鼠模型（CT26）肿瘤生长，延长其存活率（P＜0.001）。这种纳米平台能否应用并改善其他免疫调节因子的疗效仍需进一步研究。

3.3 靶向Treg 表面受体及标记物的治疗策略

3.3.1 靶向Treg 表面糖蛋白A 重复序列 糖蛋白A重复序列（glycoprotein A repetitions predominant，GARP）在活化的Treg 表面表达，可以结合并激活TGF-β，与疾病进展和免疫逃逸有关。Salem 等[27]在结肠炎相关的结肠癌模型中观察到缺乏GARP 的Treg 抑制炎症反应的能力降低，抗肿瘤免疫得到改善，肿瘤进展减缓。但Vermeersch 等[33]在小鼠结肠癌模型中的研究显示，敲除GARP 并未延迟肿瘤生长，GARP 的缺失不足以影响Treg 的免疫抑制活性。GARP 抑制剂在CRC 领域是否能成为靶点仍需进一步验证。

3.3.2 靶向Treg 表面内皮糖蛋白 内皮糖蛋白（endoglin）是TGF-β 的辅助受体，在内皮细胞、癌症相关成纤维细胞等上高表达，Schoonderwoerd 等[34]报道内皮糖蛋白可以在小鼠和人CRC 组织中的Treg 上高表达，而不存在于常规CD4+T 细胞上。抗内皮糖蛋白抗体（TRC105）在乳腺癌等动物模型中显示了抑制血管生成和肿瘤转移的作用[35]。在CRC 动物模型中使用TRC105 治疗可以减少肿瘤中Treg 的数量，TRC105 联合PD-1 抑制剂使用显著增强了PD-1 抑制剂在CRC 动物模型（皮下、原位和化学诱导）中的疗效[34]。这种策略已在转移性非小细胞肺癌中进行Ⅰ期研究（NCT 03181308），在CRC 中能否成为靶点需进一步研究。

4 结语与展望

综上所述，Treg 在肿瘤发生发展中的作用涉及到调控肿瘤免疫、血管生成和肿瘤细胞增殖等多个方面，并与肿瘤微环境中的各种成分存在相互作用，是一个十分有研究意义的靶点。Treg 在CRC 中的作用存在争议可能与研究中涉及的细胞亚群不同和所选研究群体的肿瘤分期不同有关。目前，免疫治疗多以耗竭或抑制Treg 为目标，对Treg 各亚群进行准确的评估，对于预测CRC 患者预后和选择合适的治疗策略具有重要意义。应继续研究靶向Treg 或进行联合治疗的治疗策略，在维持免疫平衡的前提下选择性地抑制Treg，发挥效应T 细胞介导的抗肿瘤免疫的优势，进而达到有效治疗的目的。