循环肿瘤细胞在肺癌精准医疗中的研究进展

李欣 周倩 综述 唐小葵 审校

肺癌每年新发病率约占全部肿瘤的12%，死亡人数占癌症总死亡人数的20%左右，是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。肺癌治疗的传统方式是手术、化疗、放疗，随着分子诊断的发展，靶向和免疫治疗成为肺癌治疗的新选择，肺癌患者诊断后的生存率也逐渐提升。随着精准医学的提出，肺癌的研究已逐渐深入分子层面，这有利于对不同患者进行分层以实现个体化医疗。传统的分子检测在实体组织中进行，但近年来基于血液的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）检测已成为具有前景的检测手段。

CTCs 是自肿瘤原发病灶或转移病灶脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，因此，CTCs 基因表达和基因突变图谱可以反映原发性和转移性肿瘤成分[2]。与传统组织学活检相比，CTCs 检测具有创伤小、可重复检测的优势，可动态提供患者疾病信息。既往研究多局限于CTCs 计数，现在对于CTCs 的研究已深入基因组谱、转录组谱、蛋白代谢物如程序性细胞凋亡配体-1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）等成分，并且可进行单细胞分析以描述肿瘤异质性特征、进行细胞培养或建立CTCs 来源的异种移植物（cell-derivede xplants，CDX）模型以实现药物筛选等[3-4]。本文将对CTCs 在肺癌精准医学中的研究进展进行论述，从指导治疗、揭示转移机制、评估PD-L1 表达等方面展开。此外，同为液体活检技术的循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）检测，已成为检测肺癌治疗靶点的常用临床手段，本文也将探讨CTCs 与cfDNA 在肺癌诊治中联合应用的价值。

1 指导肺癌药物治疗

1.1 细胞体外培养及CDX 技术与药物

CTCs 作为完整的细胞，可在体外进行细胞扩增以进行临床前药物测试。Zhang 等[5]在1 例ALK 基因重排的肺腺癌患者中，对获得的CTCs 进行检测，发现ALK 基因上的L1196M 发生耐药性突变，进一步对CTCs 进行体外扩增，比较两种间变性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶抑制剂（anaplastic lymphoma kinase-tyrosine kinase inhibitor，ALK-TKI）克唑替尼和塞瑞替尼的药物敏感性，表明塞瑞替尼疗效更突出。CTCs还可以在免疫缺陷小鼠中构建CDX 模型，用于临床前药物测试及耐药机制的分析。Lallo 等[6]通过CDX模型构建了针对小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）的临床前模型，在CDX 模型中，多聚ADP 核糖聚合酶抑制剂奥拉帕利联合Wee1 抑制剂AZD1775 的疾病控制时间较顺铂联合依托泊苷更长。CDX 模型为探究新的治疗方法提供了机会，但CDX的成功构建通常要求较高的CTCs 数量，常用于高侵袭性的SCLC，而在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的应用较少，但Morrow 等[7]通过晚期NSCLC 患者的间质性CTCs 成功构建CDX 模型，这也证明了间质CTCs 的致瘤性。总体来说，CDX模型在药物选择及新药物研发方面具有一定价值。

1.2 预测SCLC 化疗耐药性

SCLC 的化疗耐药是临床治疗的一大难题。Su等[8]对48 例SCLC 患者的CTCs 进行单细胞测序，依据拷贝数变异（copy number alterations，CNAs）建立评分系统以评估SCLC 患者初始化疗疗效。与高CNA患者相比，低CNA 患者在一线化疗后无进展生存期（progression-free survival，PFS）和总生存期（overall survival，OS）显著延长，表明不同CNA 水平的CTCs具有预测SCLC 患者的化疗疗效的潜能。同样，Carter 等[9]从6 例化疗耐药及7 例化疗敏感的SCLC患者中分离出88 个CTCs，对CTCs 进行全基因组扩增，建立基于CNA 的化疗耐药预测模型，该模型在另外18 例患者的CTCs（112 个）和基于6 例SCLC 患者的CDX 中得到验证，根据CNA 将SCLC 患者分为化疗敏感性或化疗难治性，分组的准确率达到83.3%。上述研究表明，通过CTCs 能发现不同患者间遗传模式的差异，可用于探究产生药物耐药的机制，并推动个性化治疗的进步。

1.3 预测肺癌预后

多项大型队列研究均表明晚期肺癌患者中外周CTCs 的高基线计数及计数升高与预后不良相关[10]，并有荟萃分析表明，基线CTCs 计数与肿瘤分期、淋巴结转移和预后显著相关[11]。但由于不同CTCs 表型的预后不同，不同检测方法制定的截断值不同，尚未对CTCs 的截断值进行标准化，无法确保结果的可重复性。

2 揭示肿瘤转移机制

单细胞测序能深入探索细胞与细胞之间的异同，揭示特定CTCs 亚群与肿瘤转移的相关性。Ni 等[12]对肺癌患者外周血单个CTC 进行全基因组扩增和测序，在肺腺癌和SCLC 患者中均发现来自相同患者的不同CTCs 展现出高度一致的全基因组拷贝数变异（copy number variation，CNV），并且和同一患者的转移肿瘤组织的CNV 一致，但区别于原发肿瘤。该研究还发现不同肺腺癌患者的CTCs 中CNV 具有高度的相似性。异质性是恶性肿瘤的重要特征，在CTCs中观察到的高度一致的CNV 模式提示，特定的CNV在肿瘤形成及转移中发挥重要的作用。同样，Gao 等[13]的研究也发现，原发病灶肿瘤细胞的CNV 经历不同的中间状态逐步积累，最终单个CTC 与转移病灶组织表达相同的CNV 模式，这表明肿瘤的转移过程存在基因组拷贝数变化的趋同选择，有助于了解癌症转移机制。

不同表型的CTCs 的侵袭性也存在差异，上皮-间质转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肺癌中最重要的表型转换，EMT 与肿瘤干性、侵袭性和治疗抵抗相关[14]。通常认为间充质CTCs 在肺癌患者中与较差的预后及转移相关[15]。但Fischer 等[16]在乳腺癌动物模型中的研究提示，EMT 并非肿瘤转移的必要条件，而是参与化疗耐药过程。Liu 等[17]构建转移性乳腺癌的同源性小鼠模型，研究结果表明以上皮细胞表型为主的CTCs 细胞亚型具有更强的转移和增殖能力。关于EMT 的研究仍在不断深入中。

3 PD-L1 在CTCs 表达的临床意义

根据KEYNOTE-024 试验结果，在PD-L1 表达≥50%且未发生肺癌驱动基因突变的ⅡB 至Ⅳ期NSCLC 患者中，帕博利珠单抗已获批准使用于PDL1 表达阳性的患者[18]。但有研究者在临床使用过程中发现，部分肿瘤活检PD-L1 阴性患者也会受益于PD-1/PD-L1 抑制剂治疗[19]，这说明仍需要继续探索更精准的方法用以预测治疗疗效，而CTCs 作为细胞整体可对PD-L1 的表达进行检测。

从NSCLC 患者中分离的CTCs 评估PD-L1 表达是可行的，但由于检测技术不同，PD-L1 在CTCs 的检出率存在较大差异（23.0%~95.0%），已有多项研究表明，CTCs 中PD-L1 的表达与预后不良相关[20-23]，PDL1 表达阳性的CTCs（PD-L1+-CTCs）基线数量高及治疗后数量升高通常预示较差的预后。Dong 等[20]在114 例可手术的NSCLC 患者的研究表明，基线肺静脉PD-L1+-CTCs 与预后不良相关。Boffa 等[21]在112 例NSCLC 患者的研究表明，基线时外周血PDL1+-CTCs>1.1 个/mL 患者的2年生存率为31.2%，而PD-L1+-CTCs≤1.1 个/ mL 的患者2年生存率为78.8%（P<0.01）。Kallergi 等[22]在30 例接受化疗的NSCLC 患者中发现，基线PD-L1+-CTCs>3 个/mL 的患者PFS 较短（P=0.02）。同样，Nicolazzo 等[23]的研究发现，在接受纳武利尤单抗治疗的患者中，PD-L1+-CTCs 数量增加与疾病进展相关。PD-L1 在CTCs 的表达预示疾病进展这可能与PD-1/PD-L1 介导的免疫逃逸有关。

该研究检测了PD-L1 在接受纳武利尤单抗治疗的Ⅳ期NSCLC 患者中CTCs 的表达，在19 例患者治疗前检测出PD-L1+-CTCs，其中仅5 例在治疗半年后获得了临床获益。Guibert 等[24]对96 例接受纳武利尤单抗治疗的NSCLC 患者研究表明，高基线PD-L1+-CTCs（≥1%）的患者与CTCs 中未表达PD-L1 的患者相比，治疗效果更差（68%vs.40%，P=0.04）。同样，Kulasinghe 等[25]也未观察到PD-L1+-CTCs 与免疫治疗效果的相关性。目前的研究表明，CTCs 的PD-L1表达尚无法预测PD-1/PD-L1 抑制剂治疗疗效，仍需要更多的研究探索PD-L1+-CTCs 与PD-1/PD-L1 抑制剂治疗疗效的关系。

4 CTCs 联合cfDNA 应用

cfDNA 是指游离于血液中的细胞外DNA，由于cfDNA 的检测无需预先富集，已成为检测肺癌治疗靶点的常用临床手段。但血浆中cfDNA 片段的大小分布表明，多数DNA 由凋亡细胞释放[26]，且在一些良性疾病的血液中也能检测到较高含量的cfDNA[27]，这可能会限制对治疗耐药的存活肿瘤细胞DNA 的检测；其次，无法将特定的循环肿瘤DNA（circulating tumor-DNA，ctDNA）与对应的肿瘤细胞进行匹配，限制了肿瘤异质性的评估。

与cfDNA 相比，CTCs 的检测需要更多技术的发展，但CTCs 作为细胞整体，可以分析来自活性细胞的基因组谱、PD-L1 表达，并且可以通过细胞培养或CDX 实现药物筛选等。由于CTCs 检测需要经历从血细胞中富集的过程，其检测效能在很大程度上取决于检测方法的敏感性，而不同技术平台存在差异，尚需进一步提升检测技术。相信在检测技术的支持下，CTCs 作为细胞整体在精准医学的发展上将有更大的潜能。

Sundaresan 等[28]前瞻性地研究了对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factorreceptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）临床耐药的40 例晚期肺癌患者，分别检测活检组织标本、CTCs、ctDNA 中T790M 的突变情况。结果表明T790M 突变阳性率分别为63%、50% 和50%，组织与CTCs 中T790M 检测一致率达74%，与ctDNA 的一致率为61%。将CTCs 联合ctDNA 用于基因分型，发现14 例（35%）组织活检不确定或T790M 阴性的患者存在T790M。基于此项研究反映出的液体活检与肿瘤活检的差异，表明肿瘤细胞的异质性[29]，同时也证明肿瘤活检和CTCs、ctDNA 的互补作用，在未来可考虑结合ctDNA 和CTCs 以更全面筛选突变靶点。

5 结语与展望

CTCs 技术发展最大的障碍是低效率以及无标准的检测系统，技术的限制使其在临床中的应用不及cfDNA，在未来应重视技术的优化和标准化，并联合应用CTCs 和cfDNA 以提供更全面的信息[30]。

CTCs 计数与肺癌预后不良相关。目前CTCs 的研究已深入分子层面，各种技术不断开发被用于CTCs 的研究。CDX 的研究是具有潜力的发展方向，CDX 模型的建立使得体外筛选新的治疗药物成为可能，但对CTCs 的数量要求高，在NSCLC 患者中应用仍有较大难度。近年来，单细胞技术的发展加深了对于肿瘤异质性的理解，通过基因组、转录组和表观遗传方面的分析，有望为肿瘤转移、耐药机制研究及治疗新靶点提供重要信息。但是单细胞测序技术本身尚存在局限性，未来还需要单细胞技术的不断发展和改进。

检测CTCs 的PD-L1 表达是可行的，但还需要更多的研究探索PD-L1+-CTCs 与PD-1/PD-L1 抑制剂治疗疗效的关系。有研究表明免疫检查点抑制剂的疗效可以通过基于ctDNA 的肿瘤突变负荷评估来预测[31]，但其有效性仍在评估中。

本文主要总结了分子层面的CTCs 检测在肺癌个性化诊疗的潜在临床意义。精准医疗作为肺癌发展的趋势，CDX 模型、单细胞分析及PD-L1 检测等技术将是未来CTCs 检测的重点发展方向。但技术障碍仍是阻碍其广泛应用于临床的主要原因，因此标准化检测系统的开发及技术效率的提升是亟待解决的问题。