痰液中生物活性物质在肺癌诊断中的作用和意义

金愈茗 陈子轩 陈权 沙雷皓 沈诚

1 背景

肺癌是目前全球死亡率最高的癌症[1]。当前大部分肺癌患者在诊断时已经处于晚期，晚期肺癌患者5年生存率不足15%，而Ia期肺癌患者的5年生存率可以超过80%[2,3]。因此，如何尽早发现并诊断肺癌成为提高患者生存率的关键。

随着诊断技术的发展，早期肺癌筛查在过去的几十年内有了一定的发展与进步，胸部X射线、计算机断层扫描（computed tomography, CT）、低剂量螺旋CT（low-dose spiral CT, LDCT）、正电子发射断层扫描（positron emission tomography, PET）等技术的发展使得肺癌患者的生存率逐渐提高，但肺癌确诊的金标准仍为明确的病理结果，有创操作的风险依旧不能避免[4,5]。细胞学检查能够为以上技术提供辅助诊断，但由于样本的获取及检测的局限，痰液细胞学的检测效力未能达到理想的效果[6,7]。因此临床上迫切需要一种安全性更高、准确性更高的肺癌诊断方法。

随着对肺癌的分子机制研究的深入，基因组学技术的发展，更多生物分子被证实参与肿瘤进程，促进其发生发展。二代测序及深度检测技术的出现，大幅度提升了基因检测的敏感性和特异度[8]，而通过数据分析使得准确测定组织中肿瘤基因的拷贝数成为可能[9]。液体活检中基因相关样本检测的潜力凸显。利用患者的血液、胸腔积液、唾液、痰液等样本中提取的脱氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid, DNA）片段、微小RNA（microRNA, miRNA）、信使RNA（message RNA, mRNA）、蛋白质等能够获取肿瘤组织的遗传信息，该方法无创、易于获取、可重复多次提取，具有很强的应用前景[10,11]。血液样本虽然易于提取，但其中相关基因产物含量低，且容易受机体其他代谢过程影响[12]；胸腔积液不易受其他过程影响，产物含量较高，但采集操作是有创性的[13,14]。而痰液中产物含量较适宜，且无创不易受其他过程影响，含有多种生物活性物质，如蛋白质、DNA、miRNA、mRNA，是理想的液体活检样本。本文回顾了痰液中生物分子标记物在肺癌中的相关机制和应用价值。

2 痰液中的DNA

正常细胞在发生坏死和凋亡过程中可能会将部分DNA释放到内环境中，而肿瘤细胞释放的DNA片段带有肿瘤特有的遗传特征，对肿瘤的诊断具有重要价值。对含有肿瘤DNA的痰液进行检测，具有经济、安全、无创的特点，同时，肿瘤细胞遗传物质的改变通常发生于产生临床症状之前，对遗传物质的检测具有一定的前瞻预防性，而且，可多次反复取样还可以连续动态监测肿瘤基因，从而提示肿瘤的发生与发展[7,10,15,16]。肿瘤细胞遗传物质DNA的改变是复杂且精密的，与癌症的发生发展密切相关，当前用于肺肿瘤细胞诊断的DNA遗传特征改变主要包括DNA的突变（DNA mutation）和异常甲基化（aberrant DNA methylation）。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是检测DNA变异的常用技术，该技术简单易行、经济快速、敏感性较高[17]。DNA异常甲基化被认为是一种肿瘤细胞调控的机制，甲基化特异性PCR（methylationspecific PCR, MSP）是检测DNA甲基化的常用方法。

Keohavong等[18,19]的工作证明了KRAS突变及p53突变可能适用于对肺癌高危人群中的痰液筛检，但当前对KRAS和p53基因检出时间和肺癌进展间关系的研究仍待完善。多项研究[20-22]显示，p16、PAX5α、GATA5、SULF2等基因的异常甲基化在肺癌早期筛查中的特异性超过70%。Hulbert等[16]的病例对照研究同样发现了HOXA7、SOX17等基因的异常甲基化检测的特异性超过80%。但这些基因用于筛查的敏感度不高，均低于70%。由于肺癌的发生涉及到复杂的遗传信息调控过程，当前的研究尝试将多种基因同时检测，以期提高敏感性，研究显示，同时对多个基因甲基化检测可以提高肺癌筛查和早期诊断的敏感性[23,24]，可以将敏感性提高到98%，而机器学习的方法也可以通过多基因组合检测诊断出91%的肺癌[16,25,26]。痰液中多基因联合检测具有高特异性和敏感性，有望成为肺癌筛查和早期诊断的方向，需要更大样本、更多基因的联合研究和深入分析提供进一步的支持。

LDCT与痰液中DNA异常甲基化检测的结合也能使肺癌筛查的效率提高，对在LDCT上发现可疑结节的患者进行痰液生物活性物质检测能够得到63%-86%的敏感性和75%-92%的特异性[16]；Leng等[27]的研究也提示痰液生物活性物质检测能够排除1/3 LDCT的假阳性。而针对肺癌的诊断上，根据大量的病例研究和动物实验表明，原癌基因KRAS和抑癌基因p53在肺癌的发生发展中具有重要的作用[28]。Somers等[29]对肺腺癌患者的痰液进行了研究，结果提示KRAS基因的点突变可以在肺腺癌患者的痰液中检测到，为后续的检测的发展奠定了基础。Destro等[18]在一项对照实验中发现，肺癌患者中痰液样本检测出KRAS突变（79%）而对照组无一阳性，虽然当前针对痰液中KRAS和p53对于肺癌诊断的研究仍未有统一的结论，但KRAS和p53在肺癌发展中起着核心作用，结合痰液检测的无创性特点，痰液中KRAS和p53检测在今后肺癌的诊断技术中仍具有潜力。除了单基因检测，联合检测DNA甲基化和miRNA被证实可以显著提高检测的特异性和敏感性。研究[30]显示，同时检测2种miRNA（miR-31, miR-210）和2种DNA甲基化（RASSF1A和3OST2）能够获得87%的敏感度和90%的特异性。痰液中生物活性物质在肺癌诊断中具有很大的潜力，为了进一步验证检测的敏感度和特异性，需要多中心、大样本临床研究提供更充分的证据[18,19]。

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）相关基因突变被认为是肺腺癌发生的机制之一，痰液中EGFR突变对于诊断的影响也在研究之中，研究发现EGFR突变可能与女性或非吸烟患者的肺腺癌有关，肺癌的不同亚型可能会成为影响EGFR突变检出率的原因，同时，当前研究较小的样本量所能具备的代表性也值得进一步探究[31-34]。在临床治疗中，针对EGFR突变的靶向药被广泛证实有显著的疗效，EGFR突变的检测对非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）有着重要的作用[35,36]，研究[33]显示，在已经明确诊断为EGFR突变型NSCLC的患者中，30%-50%的患者可以在痰液中检出这一突变，且所有对照组中均不能检出。另一项相似的研究的结果[37]显示，痰液中检测EGFR突变可以得到46.2%的敏感度和100%的特异性。虽然敏感度不够理想，但这些研究揭示了痰液EGFR突变检测可以在早期获得肺癌患者EGFR突变状态。间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）也是NSCLC的常见治疗靶点，针对此基因突变的许多靶向疗法具有显著的疗效[38]，但当前尚未有针对痰液中ALK突变的检测研究。针对其他靶点如MET、BRAF的研究同样缺乏[30]。

3 痰液中的miRNA

miRNA是一种稳定的非编码单链小核苷酸序列，它们主要通过与位于靶mRNA 3’-非翻译区（untranslated area,UTR）内的种子序列结合来调控致癌和/或抑瘤基因，最终导致靶mRNA失活和降解，从而调节基因表达，参与调控肿瘤进程。大量研究[39-41]发现，miRNA基因的异常表达与肺癌的发生发展相关，一类miRNA作为抑癌基因发挥作用，如let-7家族（let-7a、let-7c）、miR-1[42]可抑制癌细胞的增殖及耐药，miRNA-1、miRNA-206[43]可通过减少肿瘤血管生成而抑制肿瘤的生长与转移，现发现miRNA-126、miRNA-494也有一定致癌作用[44-47]。另一类则作为致癌基因发挥作用，其高表达可促进肺癌的进展，如miR-103-a可增加血管生长因子的表达[48]，miR-31可引起肿瘤支持可溶性因子与侵袭性增加[49]，miRNA-17家族（miRNA-17、miRNA-18a、miRNA-19a、miRNA-20a、miRNA-19b-1、miRNA-92a-1）[50]、miRNA-335[51]、miRNA-155[52]、miRNA-183[53]均在肺癌组织中表达增加。

肺癌亚型传统上依赖于切除标本、支气管镜活检、细针穿刺的组织病理学观察，这些样本的采取方式对患者的侵袭性大[54-56]，然而研究人员[57,58]发现，内源性miRNA以稳定的形式存在于痰液中，且对RNA酶具有抗性，此外在7 d内的痰液样本中也可以被检测出来，过去15年里痰液中miRNA检测越来越多地被用于肿瘤早期筛查与诊断。Zhang等[59]为评估痰液标本中miRNA的异常表达是否可以作为NSCLC的有用生物标志物，纳入了14篇文章，包括1,009例NSCLC患者和1,006例健康者对照，结果显示联合敏感性、特异性、阳性似然比（positive likelihood ratio,PLR）、阴性似然比（negative likelihood ratio, NLR）、诊断优势比（diagnostic odds ratio, DOR）和曲线下面积（area under the curve, AUC）分别为0.75（95%CI: 0.72-0.78）、0.88（95%CI: 0.86-0.90）、5.70（95%CI: 4.82-6.75）、0.30（95%CI: 0.26-0.34）、22.43（95%CI: 17.48-28.79）、0.89，提示痰液标本中的miRNA可能是NSCLC的无创性诊断生物标志物。

肺癌患者痰液中miRNA-21、miRNA-155、let-7a的含量与良性肺疾病患者与健康者的的痰液中含量差异显著，miRNA-21与miRNA-155在肺癌患者痰液中含量增高，而let-7a含量则相反[60]。Yu等[58]纳入36例肺癌患者和36例健康者对其痰液进行标记物优化，鉴定出7种表达显著改变的miRNA，4种在肺癌患者中高表达，3种低表达，最终选择4种miRNA（miRNA-21、miRNA-486、miRNA-200b和miRNA-375）组合，其对诊断肺腺癌的灵敏度和特异度分别为80.6%和91.7%。Roa等[61]检测肺癌患者痰液中5种miRNA（miR-21、miR-143、miR-155、miR-210、miR-372）含量增加，随后进行双盲定量分析，结果发现对诊断肺癌的敏感度和特异度分别为83.3%和100%。Xing等[62]通过实时定量反转录-聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RT-PCR）对48例I期肺鳞癌患者和48例健康人的痰中miRNA标记，鉴定出6种miRNA，其中3种过度表达，另外3种表达不足，最终筛选出3种miRNA（miRNA-205、miRNA-210和miRNA-708），其在区分肺鳞癌患者和正常受试者方面具有73%的敏感性和96%的特异性。Ulivi等[63]和Su等[64]同样采用多种miRNA联合检测肺癌的方式，也拥有较好的检测能力。

提示痰液miRNA检测对肺癌的早期筛查与诊断有一定价值和意义，痰中的miRNA表达水平极为稳定，收集后1 d-7 d每天基本不会改变[65]。但该方法具有一定局限性，从患者身上采集的样本中细胞数量不同可能导致miRNA含量不稳定，且许多患者伴有呼吸肌疲劳、无力等症状，这使痰液的采集变得十分困难，部分患者痰液量减少甚至无痰。并且目前仅有少数miRNA能提供较好的诊断效果，而miRNA对癌症的调控作用也未能在诊断中有所反映。基于痰液miRNA对于肺癌诊断和筛查无疑是良好的工具，但对利用miRNA的定量分析对肺癌预后治疗、随访的评价作用未有报道，或许可成为研究的新方向。

4 痰液中的mRNA

mRNA，是由DNA单链作为模板通过转录产生、携带遗传信息、能参与蛋白质合成的一类单链核糖核酸。相较于miRNA，mRNA在痰液中降解快，因此有必要尽快对采集后的痰液标本进行检测或及时保存；目前常应用RTPCR法对mRNA序列进行检测，对肺癌进行诊断和筛查。

Dong等[67]应用反转录PCR（reverse transcription-PCR,RT-PCR）法检测104例肺癌患者痰液标本，并与传统细胞学检测结果比较，肺癌患者痰标本Survivin mRNA的阳性率为60.6%（63/104），提示痰液mRNA作为肺癌筛查的可能性。Sun等[68]应用实时定量RT-PCR法检测了75例肺癌组织和71例相应痰标本中APRIL mRNA的表达，并进行相关性分析，结果表明肺癌、肺部良性疾病和健康志愿者的APRIL mRNA表达阳性率分别为81.7%（58/71）、3.2%（2/62）和1.5%（1/65）；肺癌患者痰液中APRIL mRNA的表达水平明显高于良性肺部疾病患者和健康志愿者。印记位点调节物兄弟因子（brother of the regulator of imprinted sites, BORIS）作为癌基因也在肺癌患者痰液中被检测到，BORIS阳性则有淋巴结转移、病理结果为进展期的提示[69]，提示了其在预后、治疗方面的作用。

Chen等[70]建立了一种新的PCR方法：Template-Ready PCR（TRPCR），提高了PCR的灵敏度；应用这种方法检测858例肺癌患者和480例非恶性肺部疾病志愿者的痰液标本中的人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, HTERT）mRNA，其阳性率分别为84.15%（722/858）和3.96%（19/480），差异有统计学意义。由于mRNA易降解的特性，其痰液检测受到限制，未有研究报道其生物学特性在肺癌复发、随访等方面的作用，但mRNA具有的基因特性仍具有较大潜力。

5 痰液中的蛋白质

21世纪以来，蛋白质组学技术不断得到发展与补充，利用该技术检测对应的生物标志物在疾病的筛查、诊断和预后中发挥着不可或缺的重要作用。肺癌患者的痰液中可以检测出敏感性好、特异性高的生物标志物，将会大大提高肺癌早期检测成功率，从而更好地进行肺癌的治疗和预后[71]。

Rangel等[73]利用透明质酸（hyaluronan, HA）区分肿瘤患者和无肿瘤患者的敏感性为80%，特异性为66%，拥有较好的敏感度，在肺癌筛查方面具有较大潜力。Yu等[72]研究了I期肺癌患者的诊断方式，在痰上清液中利用蛋白质组学技术发现EN01蛋白水平增高，敏感性为58%，特异性为80%。Pio等[74]证实了肺癌患者痰中存在补体因子H的水平升高，补体因子H检验的敏感性和特异性分别为80%和88%；他们认为分子生物标记物的测量，如补体因子H，未来可能作为细胞学检测的辅助手段用于恶性肺部疾病的诊断。Li等[75]利用蛋白芯片和ELISA技术开发了三种肿瘤抗原相关自身抗体（tumor antigen-associated autoantibody,TAAb）DDX6、ENO1和14-3-3ζ作为诊断肺癌的生物标志物，其敏感性和特异性分别为81%和83%。

对痰液中蛋白质的检测拥有较高的特异性和敏感度，具有良好的诊断性作用，而通过蛋白质定量检测来判断肺癌进展程度的报道较少。

6 展望

痰液中生物标志物具有良好的肺癌诊断能力，但痰液标本收集则会干扰诊断的能力，故对痰液标本的收集是值得研究的方向。痰液中生物标志物大多为RNA，其稳定性不高，易分解，采样后及时检测也是提高检测能力的方法之一。血液中存在可评估肿瘤进展和治疗效果的生物标志物，而痰液中也可能存在类似的物质，除用于肺癌诊断也可用于对肺癌状态的实时检测。痰液中存在多种可用于检测的物质，联合诊断往往可以提高诊断的能力，目前较多研究为同类物质的联合检测，而不同物质如miRNA联合蛋白或miRNA联合DNA的检测方式还未有报道。同样生物活性物质的检测也可与LDCT联合诊断肺癌并提高二者的准确性[16]。

由于血清和血浆相比于痰和全血，具有更大的特异性和敏感性[66]，近年来对痰液生物活性物质的研究热度有所降低，较少研究利用定量检测对肺癌进程进行分析，而痰液中含有大量可检测的生物标志物，随着检测方式的不断改进，其在肺癌的诊断甚至治疗预后中的作用将会越来越大。