肿瘤突变负荷在胃癌中的应用研究进展

卫江鹏，余鹏飞，杨钧，王伟东，高瑞祺，杨西胜，李晓华，季刚

（中国人民解放军空军军医大学第一附属医院胃肠外科，陕西西安710032）

胃癌（gastric cancer，GC） 是世界上第三大癌症相关死亡原因[1]。中国2015年胃癌新发病例67.91 万例，死亡49.8 万例，占世界胃癌死亡人数的一半以上[2]。以免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICI） 为主的免疫治疗显著提高了晚期恶性肿瘤患者的客观缓解率（objective mitigation rate，ORR）和总生存期（overall survival，OS），但并非所有患者在免疫治疗获益，因而需要发现更好的预测标志物，并筛选出对免疫治疗潜在获益的患者亚群，同时进一步阐明免疫治疗方法具体机制。肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）是指特定基因组区域内每兆碱基对（Mb）体细胞非同义突变的个数，可以间接反映肿瘤产生新抗原的能力和程度，已被证实可预测多种肿瘤的免疫治疗疗效[3-5]，但在胃癌临床研究和实践过程中TMB 评估尚无统一结论，本文现就TMB 在胃癌免疫治疗领域的研究进展进行文献综述，旨在为胃癌患者的免疫临床治疗提供一定的基础和依据。

1 TMB概述

TMB 是肿瘤基因组去除胚系突变后的体细胞突变数量，是指在肿瘤细胞基因组中,所评估基因的编码区发生置换、插入和缺失性突变的总和，即体细胞突变的总数，也可以非同义突变来表示[3-5]。肿瘤细胞在基因层面上可发生大量具有特异性的突变，突变基因可产生新的蛋白，这些蛋白或其降解产物被主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC） 递呈至肿瘤细胞表面形成肿瘤新抗原，每150 个非同义突变可能产生1～2 个新抗原,这些新抗原则可被自身免疫系统识别,从而激活CD8+T 细胞,引起免疫反应[6-7]。当非同义突变越多,则会有越多的新抗原被自身免疫系统识别，可引起的自身免疫效果则越强,因此当TMB越高，就越容易从免疫抑制剂治疗中获益[8-9]，因此理论上来说，TMB 有望成为ICI 的疗效预测标志物。

2 胃癌TMB检测方法

目前临床实践中组织肿瘤突变负荷（tissue tumor mutational burden，tTMB）检测最为常见，大多数研究认为血液肿瘤突变负荷（blood tumor mutational burden，bTMB） 检测准确性有待进一步验证[10]。目前推荐使用近期石蜡包埋肿瘤组织样本进行tTMB 检测，但应首先完成病理质控并确保胃癌细胞数能够满足检测要求，通过采集患者外周血、唾液或正常组织作为对照样本以过滤胚系突变对后续tTMB 评估的影响[11]。全外显子组测序（WES）是进行TMB 检测的“金标准”，多项研究发现采用WES 所得的TMB 与免疫治疗临床获益相关。但成本较高、样本需求量较大、数据分析较复杂限制了其临床引用，靶向测序Panel 聚焦于大量肿瘤相关基因，可以结合生物信息学算法快速高效检测肿瘤靶基因组改变。因此，采用靶向测序Panel 进行肿瘤基因组分析已成为WES 在临床检测的另一种选择[12-13]，目前要求靶向测序Panel 覆盖范围原则上不应约1.0 Mb，最低有效测序深度应≥500×，且其TMB 评估结果应于WES 评估的TMB进行一致性评价[11]，纳入影响蛋白质编码的体细胞突变，保证检出突变频率≥5%的体细胞突变，以确保TMB 检测值的准确性和稳定性。

3 TMB与胃癌的临床病理分子生物学关系

3.1 TMB与胃癌临床病理特征研究

目前，多个临床研究分析了胃癌组织中TMB 表达情况，并进一步评估了TMB 表达与临床病理关系。Cai 等[14]检测了153 例胃癌的TMB，平均TMB 为5.801 突变/Mb，并分为低TMB （1～5 个突变/Mb）、中TMB（6～19 个突变/Mb）和高TMB（≥20 个突变/Mb）[15]。相似的，在另一项包含58 例胃癌在内的100 000 例肿瘤标本的TMB 检测中，胃癌平均TMB值为5 突变/Mb，其中高TMB （>20 突变/Mb） 占19%[16]。在另一项研究中，因为75%的TMB<11.4 突变/Mb，因而选择≥11.4 突变/Mb 定义为高TMB[17]，但也有研究则将TMB>12 突变/Mb 定义为高TMB[18]。Cho 等[19]检测了330 列胃癌患者TMB，其中11%患者为高TMB （≥10.5 突变/Mb），其中病理分型是19% 肠型，3% 弥漫型[20]，15% 的混合/不确定类型。高TMB 易发生在中分化管状腺癌、Lauren 肠型、基质和免疫评分低、ATM 基因缺失患者，并首次发现克罗恩样淋巴（Crohn's-like lymphoid reaction，CLR） 细胞免疫反应及TNM 早期患者更易出现高TMB， 但与HER-2、 EGFR、 FGFR-2、MET 等基因表达状态无相关性。在65 岁以上女性，TNM 分期早， T1-2期，无淋巴结淋巴结转移患者中观察到高TMB。然而，TMB 值与M 分期或组织学分级之间无显著差异[21]。以上结果表明，胃癌组织TMB 值总体较其它肿瘤相对偏低，高TMB 值一般定义为>10.5～20 突变/Mb，并呈现出一定的临床病理特征。

3.2 TMB与胃癌分子生物学相关性研究

在一项纳入了375 例胃癌患者的TGCA 数据中，15.7%（118/375）患者出现高TMB，并从中筛选出632 个上调基因和979 个下调基因[22]，进一步通路分析显示高TMB 组患者与神经活性配体受体相互作用、cAMP 信号通路、钙信号通路有关。高TMB 组活化的CD4+记忆T 细胞、滤泡辅助性T 细胞、静止期NK 细胞、M0 和M1 巨噬细胞及中性粒细胞浸润均高于低TMB 组。张帅等[23]通过研究TCGA 数据库中88 对胃癌组织与癌旁组织分析了CTF1 表达与TMB 和免疫细胞浸润的关系，结果表明CTF1 高表达患者的TMB 越高。此外NOTCH3 分子作为公认的胃癌患者良好的预后因子，与TMB水平呈负相关，高NOTCH3 表达的患者的TMB 评分明显低于低NOTCH3 表达的患者，而在NOTCH3 高表达的患者中，IPRES 标志（代表对ICI 治疗的抵抗）和TIDE 评分（描述CD8+T 细胞的功能障碍和衰竭）均较高[24]。

P53 基因是最重要的肿瘤抑制因子之一，与肿瘤的发生有关在广泛的癌症相关途径的调控中，如细胞周期、凋亡、DNA 损伤修复、代谢、炎症等以及免疫反应、血管生成和转移。TP53 突变可能导致染色体/基因组突变不稳定性从而提高TMB值。对356 例胃肿瘤组织的基因测序结果表明，TP53 突变型较野生型组有更高的TMB 水平[25]，这一结果表明TP53 引起TMB 水平改变程度取决于细胞内环境。对免疫因子的检测发现，TMB 水平与自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）水平，细胞溶解水平、抗炎因子比例及M1/M2 巨噬细胞比例水平相关，这进一步解释了TP53 突变的胃肿瘤组织更容易发生免疫豁免[26]。

此外，Li 等[27]通过Hub 基因分析确定了6 个影响胃癌预后的基因，分别是FBN1、FN1、HGF、MMP9、THBS1 和VCAN，这6 个基因的非沉默突变在TMB 高表达中发挥重要作用，并可能通过影响肿瘤纯度。同时他们进一步发现CXCR4 基因高表达的患者有较低TMB 值[28]。其它分子如ANTXR1、DYNC1H1、CENPF 及KIF26B 突变均与TMB 值相关[22,29]。但以上结果均为TMB 与胃癌生物分子相关性研究，均未能进一步阐明具体机制，未来有待进一步基础研究。

4 TMB与胃癌免疫治疗

4.1 胃癌中TMB、MSI及PD1/PDL1表达的关系

Weinberg 等[30]分析了581 例胃癌标本，其中9.3%的肿瘤为PD-L1 阳性，当PD-L1 是1+时（1%阈值）有30（5.2%）例的患者是高TMB 或MSI-H，若以PD-L1 是2+为阈值则有64 例的患者是高TMB或MSI-H，同时研究发现原发肿瘤的高TMB（8.8%vs.3.9%）的发生率高于转移瘤。一项对食管胃结合部肿瘤的研究发现在PD-L1 阳性和阴性患者中平均TMB 值分别为6.1 突变/Mb 和3.7 突变/Mb，两组比较有统计学意义，表明TMB 与PD-L1 存在相关性[31]。在一项对330 列胃癌患者检测中显示，高TMB 在MSI-H（n=19）中最高，但也有部分在MSS组中TP53 突变型（n=10） 和TP53 野生型（n=8）分布。高TMB 组PD-L1 阳性率（78.4%） 高于低TMB 组（64.6%），但差异不显著。然而，在高TMB 亚组中，MSI-H 患者PD-L1 阳性率最高[19]。

4.2 TMB对免疫治疗的预测价值

一项研究表明中国胃癌中MSI-H 的检出率较低（2.3%）[32]，而来自其他国家的胃癌患者中MSI-H为18%～22%[33-34]，这表明MSI-H 可能并不适用于筛查胃癌患者对免疫治疗的反应，联合其他生物标志物的预测价值有待进一步研究。TMB 作为新型的免疫治疗标志物，多篇文章报道了肿瘤患者TMB 越高，预后越好[18,35-36]。Kim 等[37]通过回顾性分析63 例接受免疫治疗的晚期胃癌患者临床资料，评估了TMB 是否与免疫治疗反应相关，并探讨其与进展期胃癌免疫治疗反应的其他生物标志物的关系，结果表明高TMB 与ICI 治疗有效性、化疗有效性相关，高TMB（≥14.31 突变/Mb）组无进展生存期延长，化疗难治组的中位TMB（8.43 突变/Mb）明显高于化疗初治组（3.42 突变/Mb），因而TMB可作为ICI 治疗进展期胃癌患者的预测性生物标志物，有助于临床决策。另一项研究表明TMB 较PDL1 可更有效预测托利帕利单抗治疗进展期胃癌的治疗效果，其中高TMB（≥12 突变/Mb）组的OS 明显优于低TMB （<12 突变/Mb） 组（14.6 个月vs.4.0 个月），这项研究是第一次确定TMB 作为胃肠道肿瘤免疫检查点抑制剂治疗的预测性生物标志物[38]，但其中1 例PD-L1 阴性和低TMB 的患者仍可从托利帕利单抗治疗获益，这表明还应进一步研究TMB 在对PD-1 抗体单一治疗有反应的胃癌患者的作用[39]。

在食管胃结合部癌患者中，高TMB 患者接受包括PD-1/PD-L1 或CTLA4 免疫治疗时可获得更好的OS，但亚组分析中126 例的OS 无统计学差异[40]。随着TMB 每增加1 个单位，PFS 和OS 均有明显改善，但在多变量分析中，TMB 作为一个连续变量与PFS 或OS 之间无显著的关联，但当TMB 按四分位数分类时，TMB>8.78 时PFS 和OS 均有显著改善[40]。通过建立TMB 预后风险评分（TMB prognostic risk score，TMBPRS），以此分为高风险组和低分险组，结果发现高风险组总体1年OS 较差[41]。以上结果表明，胃癌高TMB 患者可从免疫治疗中获益更多，但目前总体研究数量较少，不同研究中心间结果异质性较大，未来需进一步前瞻性多中心研究进一步验证TMB 对胃癌免疫治疗的预测价值。

4.3 TMB 联合其它免疫分子标记物对免疫治疗的预测价值

由于单纯TMB 可能无法完全有效地筛选ICI 获益人群，同样现在广泛应用于ICI 疗效预测分子标志物的PD-L1 也不能完全精准地筛选临床获益者，这使得人们开始探索是否可以协同使用多个不同的分子标志物来共同作为ICI 疗效预测的指标。

为更好的预测免疫治疗所带来的持续获益效果（durable clinical benefit，DCB），Lu 等[42]将TMB与肿瘤拷贝数变异负荷（copy-number alterations，CNA）联合应用，发现CNAs 和TMB 之间未观察到显著相关性，表明两个基因组决定因素之间没有相关性，TMB 高/CNA 低亚组的DCB 患者比例显著高于TMB 低/CNA 高亚组（12/14）。另一项对56 例胃癌患者预后多因素分析结果显示，基线病变数（baseline lesion number，BLN)是胃癌OS 的独立危险因素，BLN 和TMB 联合应用时，低BLN 高TMB 组的疗效和生存率最高，高BNL 低TMB 组的疗效和生存率最差。

EB 病毒（EBV）感染与胃癌之间的关系已为人们所知，并被认为是胃癌分子分类的重要因素之一。He 等[43]148 例胃癌患者组织检测，其中EBV阳性组织中TMB 的平均水平明显高于阴性组，进一步的检测发现EBV+/TMB-high 亚型的突变基因包括与JAK/STAT 通路密切相关的基因，如STAT4、CCND3、CCND2、SOCS1、JAK1 和JAK3，与EBV+/TMB-low 亚型相关的特定基因经常涉及DNA 损伤和错配修复途径， 包括MSH2、 FANCE、 PMS2、RAD50、RPA1、IKBKE 和MUTYH 等基因。将EBV与TMB 两者联合应用于生存分析，结果表明在EBV 阳性患者高TMB 较低TMB 有更好的OS，但在EBV 阴性患者TMB 水平对OS 的影响无统计学差异。

综上，TMB 的水平与胃癌临床病理存在多种相关性，但具体机制仍不明确。TMB 的最佳临界值仍需在未来更大的队列中进行彻底的研究，并进一步建立分级标准，以便于更好的开展临床研究。虽然越来越多的证据表明，TMB 与接受ICI 治疗的胃癌的疗效之间存在着显著的相关性，但TMB 的效用仍然存在争议，未来需联合其它分子标记物更好的预测胃癌ICI 治疗的效果。